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体外培养成人成骨细胞-调度自动化论文

发布时间:2014-07-24 13:48  文章来源:笔耕文化传播
调度自动论文:

关键字: 调度自动论文发表    制造自动化技术论文     电力调度员论文 

   摘 要:目的:改良成人成骨细胞消化培养方法,以满足在细胞学水平进行骨代谢性疾病研究的需要。方法:取无菌骨碎片,先用胰蛋白酶消化多次,以去除血细胞和成纤维细胞;骨片经短期培养后,再次使用胰蛋白酶消化,得到大量纯净成骨细胞。细胞长至汇合后生成黑色结节。分别采用NPP底物法、125I标记放射免疫(RIA)法和Ⅰ、Ⅲ型胶原顺序沉淀抽提、SDS-PAGE还原电泳法测定细胞上清中成骨细胞主要特征性分泌物:大量碱性磷酸酶(AKP)、骨钙素(OCN)和Ⅰ型胶原。 结果:黑色结节经四环素染色,荧光显微镜下观察为骨结节特征性的金黄色。成骨细胞上清中AKP分泌量为(2.76±0.56) IU/ml、OCN分泌量为(1.875±0.549) ng/ml,明显高于成纤维细胞(P<0.01)。可检测到Ⅰ型胶原而无Ⅲ型胶原。结论:此改良方法可以在短期内得到大量性状稳定成骨细胞,同时避免成纤维细胞混入。
   关键词:成骨细胞 碱性磷酸酶 骨钙素 胶原
  成骨细胞特征性表型为分泌骨钙素(OCN)、大量碱性磷酸酶(AKP)和Ⅰ型胶原’而无Ⅲ型胶原分泌[1]。我们采用改良骨组织消化培养方法,将骨片经短期培养后’再用胰蛋白酶消化’加快骨细胞的释放。经形态学观察及特征性分泌物检测证实’获得成骨细胞数量多,并与纤维细胞有明显区别。
  材料与方法
  一、液体的配制
  0.25%胰蛋白酶用trypsin(1:250 DIFCO’Detroit’Michigan)溶解于d-Hank’s液,抽滤灭菌。培养液使用DMEM+HAM F12 1∶1混合液(GibcoBRL’Grand Island’NY)’加20%灭活新生牛血清、青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml。低血清培养液为5%灭活新生牛血清,其余同培养液。使用25 cm2培养瓶(NUNCLON’Denmark)。
  二、骨组织片消化
  取骨科手术中获得的无菌骨碎片’彻底去除骨膜及软组织;用无菌Hank′s液冲洗3次’剪碎至体积小于1mm3;Hank′s液多次冲洗至骨片发白’放入锥形瓶内’加入0.25%胰蛋白酶(骨碎片10倍体积)’37℃水浴中消化(30 min×5)’去掉上清。剩余骨片浸泡于培养液中’置37℃ CO2培养箱内2~3 d后’吸出培液’加入0.25%胰蛋白酶’37℃水浴中消化30 min’上清液经尼龙网过滤后’离心10 min(1000 r/min)’去掉上清液’沉淀物用培养液打匀’接种于25 cm2培养瓶内’重复3次’直至离心后无沉淀物为止。
  将消化后的骨片浸泡于培养液中’2~3 d后’重复上述胰蛋白酶消化步骤’仍有细胞释放’根据所需细胞量’可重复数次。接种后培养瓶内培养液较浑浊’10 h后即有贴壁细胞’72 h后’细胞完全贴壁’可冲洗、换液。此后隔日换液。取第二、三代细胞,消化后,以1×105/ml浓度接种于培养瓶中,每瓶4 ml’5 d后换低血清培养液6 ml,24 h后收集上清液,分装于5个离心管内,-18℃保存’用于检测。
  三、成骨细胞特征性鉴定
  以皮肤成纤维细胞作为对照,鉴定实验所得成骨细胞。
  1.形态学观察:除常规形态学观察外,采用趋骨性荧光素标记细胞培养生成结节。细胞培养瓶内加入四环素’使终浓度为50 μg/ml’培养箱内培养1 h’换新鲜培养液培养1 h,经Hank′s液冲洗3次’乙醇梯度脱水’固定’Olympus-Vanox-T显微镜落射荧光观察。
  2.成骨细胞上清液AKP检测:采用磷酸对硝基苯酯二钠盐(p-Nitrophenyl phosphate disodium salt’NPP’上海丽珠东风公司)比色法[2]’无色p-NPP与AKP在37℃水浴中反应生成黄色对硝基苯p-Nitrophenol’经405 nm波长比色’测得OD值’换算成国际单位。
  3.成骨细胞上清液中骨钙素检测:采用BGP放免试剂盒(北京东亚免疫技术研究所)检测[3]。根据放射免疫竞争结合原理,125I标记OCN和样品所含OCN与OCN抗体竞争结合,使用分离剂使结合抗体沉淀,4℃离心后,γ计数器测定沉淀物cpm数,根据标准品曲线得到样品OCN含量。
  4.成骨细胞上清液中胶原抽提及检测:采用中性、酸性Nacl溶液顺序沉淀抽提[4],SDS-PAGE垂直板还原电泳法[2]。配制7.5%-0.2%bis聚丙烯酰胺凝胶板固定于垂直板电泳槽[5]。电泳液为0.05M Tris、0.38M甘氨酸、0.01%SDS(pH=8.8);样品液为0.125 M Tris、15%甘油、2 M尿素、2%SDS、0.001%溴酚兰;染色液为0.25%考马斯亮蓝R250、25%异丙醇和10% HAC;脱色液为5%异丙醇和8%HAC。样品解冻后’放55℃水浴中变性1 h’加入样品缓冲液50 μl’每个样品点2孔’每孔加样20 μl’另加Ⅰ、Ⅲ型胶原标准品’50 mA恒定电流电泳1 h后’每个样品第1孔内加入100 μl 20%β巯基乙醇(β-mercaptoethanol,Sigma)样品缓冲液’静置1 h后’13 mA恒定电流电泳12 h’染色液染色1 h’脱色液脱色24 h’拍照片。
讨 论
  一、成骨细胞体外培养方法的建立
  早在20世纪60年代’Peck和Birge[8]开始用胶原酶消化骨片’体外培养成骨细胞获得成功;1975年’Wong等[9]采用多次胶原酶消化’使培养的成骨细胞得到纯化。1985年’Robey和Termin等[10]采用低Ca2+培养液培养骨片获得成骨细胞’经过鉴定’比酶消化法得到的细胞更加纯化。本实验改良上述方法’先使用比胶原酶更便宜的胰蛋白酶进行多次消化’胰蛋白酶仅能消化骨小梁表面细胞周围的基质,而对于埋藏于骨基质中的大量静止骨细胞无作用。前5次胰蛋白酶消化液中含有骨组织中残留的血细胞、成纤维细胞、骨髓细胞及部分成骨细胞和骨细胞,因此弃之不用。剩余的骨片再用胰蛋白酶消化,无细胞释放,证实骨片中仅含有埋藏于基质中的骨细胞,笔耕文化传播,而无其它细胞。骨片在培养液中浸泡后,静止骨细胞通过骨小管内细胞缝隙连接[11]’感知外界溶液浓度变化’特别是钙离子浓度变化[10]’开始活跃起来’通过骨细胞性溶骨作用[12]释放出来’在骨片周围形成贴壁细胞’但一般要经过2周以上时间’且贴壁细胞仅出现于骨片周围[10]’数量有限。在骨细胞释放出来以前’再次使用胰蛋白酶可大大加速其释放速度和数量’既代替了胶原酶的作用’又可避免成纤维细胞的混入。消化细胞接种后,经2~3周培养可达汇合’取第2、3代细胞检测,可避免长期培养,反复传代后引起细胞分化和表型的改变。本实验结果显示,此方法简单、实用,并可获得足够数量的成骨细胞。
电力系统稳态分析论文  



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