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新型树枝状大分子造影剂的制备与生物成像研究

发布时间:2019-01-08 15:04
【摘要】:肿瘤成像是肿瘤诊断过程中重要技术手段。目前常用的人体肿瘤成像技术中,磁共振成像(MRI)因无辐射、无创伤和软组织分辨率高等优点被广泛应用,为肿瘤诊断技术的进步提供了巨大的帮助。但是MRI对肿瘤的成像灵敏度不够理想,需要使用造影剂提高肿瘤成像的对比度。目前临床上使用的大多数造影剂为小分子钆配合物,其结构简单,安全性好,但弛豫率低,清除速度过快,缺乏肿瘤靶向性,无法满足肿瘤临床诊断的要求。因此,目前亟需发展高弛豫率、长循环和肿瘤靶向的新型造影剂,提高MRI诊断肿瘤的灵敏度。将纳米载体与MRI造影剂相结合能够提高造影剂的驰豫和靶向性能。在各类纳米载体中,树枝状大分子具有结构明确、分布均一、表面基团多等优点,是一种理想的纳米载体材料。但是,目前树枝状大分子存在合成复杂、生物相容性差和缺乏抗蛋白吸附能力易被网状内皮系统清除等问题,限制了它们作为生物载体材料的应用。据此本文以多官能团化合物环糊精为核,构建了两种新型的聚甘油树枝状大分子和内部羟基化的树枝状大分子,解决了高分子量树枝状大分子合成困难的问题,并通过引入避免非特异性黏附的两性离子和肿瘤靶向基团,获得了肿瘤靶向的树枝状大分子造影剂。首先,论文以β-环糊精为核、卤代丙烯为单体,通过交替进行的Willaims和Sharpless反应合成了1-4代聚甘油树枝状大分子CPGD,并利用1H NMR、凝胶n蛲干缀蚆ALTI-TOF-MS对其结构进行了表征。该树枝状大分子以甘油醚为结构单元结构稳定,生物相容性好。与小分子为核的聚甘油树枝状大分子相比,树枝状大分子的分子量从原来最高的5.1kDa增加到18.9 kDa,表面功能团从原来的48个增加到168个。通过带双键基团的树枝状大分子与不同带巯基团的化合物反应,合成了表面带羟基、胺基、羧基和两性离子等不同基团的树枝状大分子,研究了不同表面基团对并对其的毒性、与蛋白的相互作用、细胞内吞以及器官分布的影响,发现表面带有氨基的CPGD毒性过大,生物相容性差,带羧基的GPGD在肿瘤中分布多,但细胞毒性较大且不易进入细胞,G3-OH进细胞速度快,但排出过快,而带两性离子CPGD在正常pH7.4下不与蛋白相互作用,在肿瘤的酸性pH下会与蛋白相互作用,而通过内吞作用较快的进入细胞,且能够从酸性的溶酶体逃逸,具有更好肿瘤药物/造影剂输送性能。然后,论文在两性离子的聚甘油树枝状大分子表面引入造影剂分子,获得的聚甘油树枝状大分子造影剂。该造影剂的驰豫率随大分子的代数增加而逐代增大,CPGD-G3-DOTA-Gd的弛豫率为14.3mM~(-1)s~(-1),约为Magnevist的3.3倍。两性离子修饰的聚甘油树枝状大分子造影剂能够显著降低细胞内吞,可以作为细胞外造影剂较少造影剂在体内的残留。ICR白鼠的活体成像证明了这种造影剂有很好的血池造影能力,相对Magnevist可以在较长的时间内维持对血池的增强效果,同时对血管丰富器官也有较好的增强效果,其中高代数的树枝状大分子造影剂相较于低代数具有更长的体内循环时间和更好的造影效果,而且造影剂几乎没有长期的治疗,能够避免造影剂滞留和代谢造成的系统毒性。除此之外,论文在聚甘油树枝状大分子造影剂的表面通过PEG链接引入了肿瘤厌氧靶向基团,获得了肿瘤靶向的树枝状大分子造影剂,其弛豫率为Magnevist的6.9倍,并能够在肿瘤的缺氧区域富集,显著增强肿瘤与正常区域的对比。最后,为了避免树枝状大分子表面引入造影剂破坏树枝状大分子两性离子性质。论文还以环糊精为核,通过交替进行"amine-epoxy"的开环反应和"thiol-allyl"反应合成了一种内部羟基化的树枝状大分子,并利用~1H NMR、凝胶渗透色谱对其结构进行了表征。同时,在这种树枝状大分子的内部连接造影剂,而在其表面引入两性离子与肿瘤靶向的苯磺胺基团,获得了一种新型的肿瘤靶向树枝状大分子造影剂。其中,两性离子能够避免非特异性蛋白粘附和细胞内吞,而表面的肿瘤靶向基团能够介导肿瘤细胞特异性内吞树枝状大分子造影剂,提高造影剂的肿瘤靶向性能。该造影剂的粒径约为6.2nm,驰豫速率11.3mM~(-1)s~(-1),约为Magnevist的2.7倍。细胞实验表明该造影剂具有肿瘤厌氧靶向性能,动物实验表明该肿瘤靶向树枝状大分子造影剂显著增强肿瘤的磁共振成像,并能够快速的通过肾脏排出体外,无明显的系统毒性,是一种理想的肿瘤靶向型造影剂。
[Abstract]:Tumor imaging is an important technique in the diagnosis of tumor. At present, the magnetic resonance imaging (MRI) is widely used in the imaging technology of human body tumor, which has the advantages of no radiation, no wound and high resolution of soft tissue, and provides great help for the progress of the diagnosis technology of the tumor. However, the imaging sensitivity of the MRI to the tumor is not ideal, and the contrast of the tumor imaging need to be enhanced using the contrast agent. At present, most of the contrast agent used clinically is a small molecular weight complex, the structure is simple, the safety is good, the relaxation rate is low, the clearing speed is too fast, the tumor targeting property is short, and the requirement of the clinical diagnosis of the tumor can not be met. Therefore, it is urgent to develop a new contrast agent with high relaxation rate, long circulation and tumor targeting, and to improve the sensitivity of MRI to the diagnosis of tumor. The combination of the nano-carrier and the MRI contrast agent can improve the relaxation and the targeting performance of the contrast agent. In various kinds of nano-carriers, the dendritic macromolecule has the advantages of clear structure, uniform distribution and many surface groups, and is an ideal nano-carrier material. However, the present dendrimers have the problems of complex synthesis, poor biocompatibility and lack of anti-protein adsorption ability, which are easy to be removed by the reticuloendothelial system, and the application of them as the biological carrier material is limited. By using the multi-functional compound cyclodextrin as a core, two novel polyglycerol dendritic macromolecules and internally hydroxylated dendritic macromolecules are constructed, and the problem of difficult synthesis of the high molecular weight dendritic macromolecules is solved, and through the introduction of the zwitterionic and tumor targeting groups which avoid non-specific adhesion, the tumor-targeted dendritic macromolecular contrast agent is obtained. First, a 1-4 generation of polyglycerol dendrimer CPGD was synthesized by the alternate Willis and Sharpless reaction, and 1H NMR and gel n were used as the monomer to synthesize the 1-4-generation polyglycerol dendrimer CPGD. The structure of ALTI-TOF-MS was characterized. The dendritic macromolecule has the advantages of stable structure and good biocompatibility by using the glycerol ether as a structural unit. The molecular weight of the dendrimer increased from 5.1kDa to 18.9 kDa, and the surface functional group increased from 48 to 168. The dendrimers with different groups of hydroxyl group, amino group, alicyclic group and zwitterionic group are synthesized through the reaction of the dendrimer with the double-bond group and the compound of the different groups of polar groups, and the toxicity of the groups on the surface and the interaction with the protein is studied. The effect of the endocytosis and the distribution of the organ found that the CPGD with the amino group on the surface was too toxic and the bio-compatibility was poor. The GGD with the donor base was more widely distributed in the tumor, but the cytotoxicity was large and it was not easy to enter the cell. and the zwitterionic CPGD does not interact with the protein under normal pH 7.4, and interacts with the protein under the acidic pH of the tumor, and can escape from the acid lysosomes and has better tumor drug/ contrast agent delivery performance. then, a contrast agent molecule is introduced on the surface of the zwitterionic polyglycerol dendrimer, and the obtained polyglycerol dendrimer contrast agent is obtained. The relaxation rate of CPGD-G3-DOTA-Gd is 14. 3mM ~ (-1) s ~ (-1), which is about 3. 3 times of Magnitude. The zwitterionic modified polyglycerol dendrimer contrast agent can obviously reduce the endocytosis of the cells and can be used as the residual of the contrast agent of the extracellular contrast agent in the body. The in vivo imaging of ICR mice has proved that the contrast agent has a good blood pool contrast ability, and the relative Magnitude can maintain the enhancement effect on the blood pool in a long time, and also has better enhancement effect on the blood vessel-rich organs, wherein the high-algebra dendrimer contrast agent phase has a longer in-vivo circulation time and better contrast effect than the low-algebra, and the contrast agent has little long-term treatment, so that the systemic toxicity caused by the retention and the metabolism of the contrast agent can be avoided. In addition, on the surface of the polyglycerol dendrimer contrast agent, the tumor anaerobic targeting group is introduced through the PEG link, the tumor-targeted dendritic macromolecular contrast agent is obtained, the relaxation rate is 6-9 times of the Magnitude, and can be enriched in the hypoxic region of the tumor, and the contrast between the tumor and the normal region is obviously enhanced. in that end, to avoid the introduction of contrast agent on the surface of the dendrimer to destroy the zwitterionic property of the dendrimer. In this paper, a kind of internally hydroxylated dendrimer was synthesized by the open-loop reaction and the "thiol-allyl" reaction of the "amine-epoxy", and the structure of the dendrimer was characterized by ~ 1H NMR and gel permeation chromatography. At the same time, the contrast agent is connected to the inside of the dendritic macromolecule, and a zwitterionic and tumor-targeted sulfanilamide group is introduced on the surface of the dendrimer, so that a novel tumor targeting dendritic macromolecular contrast agent is obtained. in which, the zwitterionic can avoid the non-specific protein adhesion and the endocytosis, and the tumor targeting group on the surface can mediate the tumor cell specific endocytosis of the dendritic macromolecular contrast agent and improve the tumor targeting performance of the contrast agent. The particle size of the contrast agent is about 6.2nm, the relaxation rate is 11. 3mM-(-1) s-(-1), which is about 2.7 times of Magnitude. The cell experiment shows that the contrast agent has the tumor anaerobic targeting performance, and the animal experiment shows that the tumor targeted dendritic macromolecular contrast agent obviously enhances the magnetic resonance imaging of the tumor and can be quickly discharged out of the body through the kidney without obvious systemic toxicity, is an ideal tumor-targeting contrast agent.
【学位授予单位】:浙江大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:TQ421.7

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