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富含VEGF的壳聚糖微球复合多孔钛支架治疗早期股骨头坏死的实验研究

发布时间:2019-01-02 07:56
【摘要】:背景股骨头坏死是一种骨科常见病,发病率高,致残率高,其发病机制尚不明确,但各种学说的共同点是,不同病因造成的股骨头血供障碍是股骨头坏死的主要病理机制。股骨头坏死的治疗重点是早期发现和早期治疗,在股骨头塌陷之前采取措施改善股骨头血供,促进骨再生,从而阻止病情进展或逆转病程。因此在股骨头坏死的修复中,获得良好的结构支撑和骨组织再生是治疗的关键环节。髓芯减压术结合生物材料植入是最佳方案之一,可以清除坏死组织,延缓股骨头坏死的进展,促进骨再生。钛合金具有良好的力学性能和生物相容性,是临床医学领域广泛使用的材料之一。通过构建多孔结构的支架,可以使股骨头内获得力学支撑,而且整体材料的弹性模量接近人体骨组织,降低应力屏蔽效应,为骨组织再生提供良好的微环境。VEGF具有强大的促内皮增殖、促血管生成、再血管化的作用,在体外可以促使BMSC向成骨方向分化。壳聚糖是一种无毒、生物相容性好、在体内可降解的理想的药物载体。因此,我们使用3D打印技术制备多孔钛支架,再复合以包裹VEGF的壳聚糖微球,然后在体外验证其促成骨能力,并在兔体内验证其治疗股骨头坏死的效果。方法首先使用3D打印技术制备高孔隙率、具有良好生物相容性的多孔钛支架,再使用离子交联法制备包裹VEGF的壳聚糖微球,将二者冻干复合,制得富含VEGF的壳聚糖微球复合多孔钛支架。在体外检测支架缓释VEGF的效果。将支架与BMSC共培养,使用CCK-8法检测支架对BMSC增殖的影响,使用real-time PCR方法检测成骨分化相关基因的表达量,使用ALP染色和茜素红染色研究细胞ALP的活性和钙沉积情况。构建兔股骨头坏死模型,将支架植入兔股骨头内,于术后1个月、2个月和3个月时,对兔的体重、步态进行评估,使用microCT对兔股骨头进行影像学评价,使用硬组织切片和Masson三色染色法对股骨头进行组织学评价,分析骨再生的情况,并与阳性对照组(髓芯减压术结合自体植骨)和模型组进行对比。结果1.复合支架制备和缓释性能研究:成功制备出富含VEGF的壳聚糖微球复合多孔钛支架。用于细胞培养的支架为圆柱体,直径为0.9cm,高度为0.5cm;用于动物实验的支架为圆柱体,直径为0.3cm,长度为2.5cm。扫描电镜观察可见,支架表面被壳聚糖微球覆盖,微球直径在30μm左右。ELISA结果显示,支架在21天内平稳释放VEGF,总释放量达0.42μg,是总载药量的84%,显著高于对照组(p0.05)。2.复合支架促进BMSC成骨分化的体外实验:以BMSC与支架共培养为实验组,以仅用培养基为对照组。CCK-8实验结果显示,在BMSC培养24小时、48小时,实验组与对照组的吸光度值相似(0.40±0.05 vs 0.38±0.04,0.68±0.03 vs 0.60±0.03,p0.05);培养72小时后,实验组吸光度值高于对照组(1.11±0.08vs0.90±0.01,p0.05)。Real-time PCR结果显示,培养3天、6天和12天以后,实验组ALP、BSP、OCN和CollagenⅠ基因表达量均高于同期对照组(p0.05)。ALP染色结果显示,在培养6天和12天后,实验组ALP染色的阳性率显著高于同期对照组染色的阳性率。茜素红染色结果显示,在培养6天和12天后,实验组钙结节的密度显著高于同期对照组。3.支架治疗兔股骨头坏死的体内实验:将支架植入兔体内后,兔的睡眠、进食未受明显影响,实验组步态较模型组显著改善,与阳性对照组相似。microCT结果显示,实验组的支架周围及支架内部有骨小梁形成,随着时间延长,骨小梁量增加,排列趋于规则;模型组无明显骨小梁再生;阳性对照组的情况与实验组类似。定量分析表明,术后2个月和3个月时,实验组股骨头区的骨量开始明显高于模型组(0.56±0.06vs0.41±0.003,p0.05),和阳性对照组相似(0.56±0.06vs0.57±0.05)。病理切片结果显示,实验组可在支架周围见骨小梁新生,内含丰富的骨陷窝和骨细胞,随着时间延长,胶原趋于成熟;阳性对照组亦可见到明显的骨小梁再生,且随着时间延长,植骨区的界线逐渐模糊消失;模型组未见明显的骨再生。结论富含VEGF的壳聚糖微球复合3D打印钛金属多孔支架可以有效促进BMSC增殖和成骨分化,可有效治疗实验性兔股骨头坏死,且对细胞和动物没有毒性,具有较好的应用前景。
[Abstract]:......
【学位授予单位】:北京协和医学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R681.8

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