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高表达AhR的RAW264.7细胞株的构建及对炎症细胞因子调控的研究

发布时间:2019-01-10 07:04
【摘要】:目的构建稳定高表达芳香烃受体(AhR)的小鼠RAW264.7细胞株,观察AhR对脂多糖(LPS)刺激的RAW264.7细胞炎症细胞因子表达的影响。方法构建含AhR-Flag-EGFP基因的慢病毒重组质粒载体并获得病毒上清,感染RAW264.7细胞后经嘌呤霉素筛选获得稳定表达的单克隆细胞株,通过荧光显微镜和流式细胞仪检测绿色荧光蛋白表达情况,qRT-PCR和Western blot法验证AhR基因及蛋白水平表达情况。qRT-PCR和ELISA检测LPS刺激后炎症细胞因子的表达情况。结果获得1株稳定高表达AhR的RAW264.7细胞,荧光显微镜和流式细胞仪显示其荧光率达100%,qRT-PCR和Western blot结果表明RAW/AhR稳转组相对于RAW/Vector空转组,AhR的m RNA和蛋白水平明显上调(P0.05)。LPS刺激后炎症相关细胞因子表达升高,相对于空转组,稳转组的促炎细胞因子IL-6、IL-1β的表达更低(P0.05),抗炎细胞因子IL-10的表达更高(P0.05)。结论成功构建稳定表达AhR的RAW264.7单克隆细胞株,证实了AhR对LPS刺激的巨噬细胞炎症反应具有负性调控作用,为后续进一步研究巨噬细胞中AhR的免疫调节及其他功能奠定基础。
[Abstract]:Objective to construct a mouse RAW264.7 cell line with high expression of aromatics receptor (AhR) and observe the effect of AhR on the expression of inflammatory cytokines in RAW264.7 cells stimulated by lipopolysaccharide (LPS). Methods Lentivirus recombinant plasmid vector containing AhR-Flag-EGFP gene was constructed and virus supernatant was obtained. After infection with RAW264.7 cells, stable expression monoclonal cell lines were obtained by purine mycin screening. The expression of green fluorescent protein was detected by fluorescence microscope and flow cytometry, the expression of AhR gene and protein was confirmed by qRT-PCR and Western blot, and the expression of inflammatory cytokines after LPS stimulation was detected by qRT-PCR and ELISA. Results A stable RAW264.7 cell line with high expression of AhR was obtained. Fluorescence microscopy and flow cytometry showed that the fluorescence rate of RAW264.7 cells was 100%. The results of RT-PCR and Western blot showed that the stable transformation group of RAW/AhR was relative to the empty group of RAW/Vector. The level of m RNA and protein of AhR was significantly up-regulated (P0.05). The expression of pro-inflammatory cytokines (IL-6,IL-1 尾) in stable group was lower than that in control group (P0.05). The expression of anti-inflammatory cytokine IL-10 was higher (P0.05). Conclusion the successful construction of RAW264.7 monoclonal cell lines stably expressing AhR has proved that AhR has a negative regulatory effect on the inflammatory response of macrophages stimulated by LPS, which lays a foundation for further study on the immunomodulation and other functions of AhR in macrophages.
【作者单位】: 第三军医大学大坪医院野战外科研究所第一研究室;重庆医科大学附属第一医院检验科;
【基金】:国家自然科学基金项目(81671906) 第三军医大学成果转化基金项目(2016XZH11) 创伤烧伤与复合伤国家重点实验室开放课题(SKLKF201601)
【分类号】:R392

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