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玉米赤霉烯酮抗独特型单克隆抗体的制备及无毒ELISA检测技术的初步建立

发布时间:2019-12-04 21:56
【摘要】:目的:研制玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)毒素抗独特型单克隆抗体,以替代毒素标准品用于免疫学检测,从而建立玉米赤霉烯酮无毒ELISA检测技术。 方法:1.ZEN与O-(羧甲基)羟胺(CMO)反应,衍生成半抗原ZEN-CMO,高效液相色谱串联质谱法(LC-MS)鉴定半抗原,然后采用活泼酯法将ZEN-CMO分别与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)偶联制备人工抗原,紫外吸收光谱分析法、SDS-PAGE法鉴定人工抗原偶联效果。通过动物免疫及杂交瘤制备等技术制备ZEN单克隆抗体(Ab1),并对其效价、亚类、特异性等方面特性进行鉴定; 2.在研制了ZEN单抗的基础上,将ZEN单抗(Ab1)与载体蛋白KLH偶联作为免疫原,Ab1经固定化胃蛋白酶酶切,获得ZEN单抗片段Fab,作为包被原,通过动物免疫及杂交瘤制备等技术制备ZEN抗独特型单克隆抗体(Ab2),并对其效价、特异性,类型等方面特性进行鉴定; 3.研究ZEN抗独特型抗体与ZEN毒素之间的相关性,并基于独特型-抗独特型反应初步建立检测玉米样品中ZEN无毒ELISA检测技术。 结果:1.制备了ZEN的人工抗原ZEN-BSA和ZEN-OVA,经紫外吸收光谱分析法和SDS-PAGE法鉴定,人工抗原偶联成功且偶联比分别为3.1:1、16.9:1; 2.成功获得1株稳定分泌抗ZEN单抗的杂交瘤细胞株,命名为1G4,其细胞培养上清效价为1:6.4×10~3,,腹水效价为1:1.6×10~5,抗体亚类为Ig G2b,对ZEN的IC_(50)为10.2ng/ml,检测限为0.58ng/ml; 3.成功制备出ZEN单抗的Fab片段, Western blot结果表明Fab分子量为50kD,间接ELISA结果表明Fab保持较高生物学活性; 4.成功获得6株稳定分泌ZEN抗独特型抗体(Ab2)的杂交瘤细胞株,分别命名为1D5、2D9、3F8、3H8、6D8、2B7,细胞培养上清效价均达到1:120以上,腹水效价为1:1.2×10~5~1:2.0×10~5,间接竞争ELISA结果表明这6株单抗(Ab2)与ZEN竞争结合ZEN单抗1G4(Ab1),均为β型抗独特型抗体(Ab2β),这6株抗体对ZEN的IC_(50)值在10.09~54.48ng/mL之间; 5.利用ZEN单抗(Ab1)及ZEN抗独特型抗体(Ab2β)建立了检测ZEN无毒ELISA定量检测技术,ZEN抗独特型抗体与ZEN毒素之间的替代标准曲线方程为:y=57.21x-7.711,R~2=0.990(y为ZEN毒素浓度ng/mL;x为抗独特型抗体浓度μg/mL),检测限为2.63ng/mL,线性范围为2.63~100.64ng/mL,实际玉米样品的加标回收率为82.13%~88.41%。批内变异系数在8.25%~9.35%之间,批间变异系数在6.54%~9.41%之间。 结论:1.成功获得了高效价,高特异性的ZEN单抗(Ab1); 2.成功制备了ZEN抗独特型单克隆抗体(Ab2),经鉴定为β型抗独特型抗体(Ab2β); 3.ZEN抗独特型单克隆抗体作为毒素的替代物与ZEN毒素标准品之间有较高的相关性,可以替代ZEN标准品用于免疫学检测; 4.利用ZEN单抗及抗独特型抗体初步建立了能用于检测玉米样品中ZEN无毒ELISA定量检测技术。
【学位授予单位】:暨南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R392

【引证文献】

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1 田洁;三唑磷、氯霉素、玉米赤霉烯酮化学发光酶免疫分析方法研究[D];浙江大学;2013年



本文编号:2569780

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