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人骨髓间充质干细胞与脐静脉内皮细胞共培养构建组织工程骨颗粒的实验研究

发布时间:2019-12-06 02:10
【摘要】:目的: 随着骨组织工程由基础研究向临床过渡,面临着血管化的问题。目前构建的组织工程骨植入体内后血管生长速度不能满足种子细胞营养和氧需要。本实验将脐静脉内皮细胞与骨髓间充质干细胞作为种子细胞,观察体外共培养时两种细胞的相互作用和功能影响,并通过构建组织工程颗粒骨模型,探讨共培养在骨组织工程血管化研究中的应用。 方法: 1.用密度梯度离心法分离骨髓血中的HBMSCs,通过流式细胞术和多向分化能力对其进行鉴定。 2.胶原酶灌流消化法获得HUVECs,观察其生长增殖情况,通过免疫组织化学和流式细胞术对其进行鉴定。 3.将HBMSCs和HUVECs在体外1:1直接共培养,Matrigel实验观察共培养对HUVECs体外血管形成能力的影响。将HBMSCs成骨诱导7d后,去除成骨诱导液,加入HUVECs,茜素红染色观察共培养对其成骨分化能力的影响。 4.将HBMSCs接种在珊瑚颗粒上,体外成骨诱导7天后,用HUVECs+藻酸盐凝胶包裹植入裸鼠皮下,另设不加HUVECs的单纯HBMSCs+珊瑚+藻酸盐凝胶组和无细胞的单纯珊瑚+藻酸盐凝胶材料组,分别于1、2、4、6、8、10周取材,组织学染色观察其成骨及成血管情况。 结果: 1.密度梯度离心法可分离出纯度较高的HBMSCs,高表达间充质干细胞标志CD29、CD90,不表达造血干细胞标志CD34、CD45,能在体外稳定扩增并保持多向分化能力。 2.胶原酶消化获取的血管内皮细胞活性好,PECAM-1免疫组化染色阳性,高表达成熟内皮细胞表面标志CD31,低表达内皮祖细胞及造血干细胞表面标志CD34及血管粘附分子CD106。 3. HBMSCs与HUVECs体外直接共培养细胞相容性良好,Matrigel实验显示共培养组形成的毛细血管状结构较单一细胞组多。成骨诱导的HBMSCs去除成骨诱导液后,共培养组茜素红染色阳性,单一细胞组茜素红染色阴性。 4.体内实验结果显示,共培养组和单纯HBMSCs组成骨良好,随着时间推移支架降解,骨小梁增多并逐渐成熟。但共培养组并未观察到更明显的血管化,与单纯HBMSCs组之间的新骨形成情况无明显区别。 结论: 通过密度梯度离心法可分离获得纯度较高的HBMSCs,经体外培养能保持多向分化潜能;胶原酶消化法能获得活性高的HUVECs。HBMSCs和HUVECs体外直接共培养时存在协同作用,HBMSCs能促进HUVECs形成毛细血管状结构,而HUVECs能促进成骨诱导的HBMSCs的矿化形成能力。以HBMSCs为种子细胞构建的组织工程化骨颗粒在体内成骨良好,但本实验中共培养的HUVECs在体内存活效率不高,共培养组没有观察到优于单纯细胞组的新生血管,可能是由于构建的支架材料和方法存在不足,需要进一步探索和研究寻求更适于共培养体系构建的支架和方法。
【学位授予单位】:北京协和医学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R329

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本文编号:2570210

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