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噬菌体天然抗体库淘选及筛选方法的优化

发布时间:2020-09-16 21:12
   噬菌体天然抗体库通常具有库容大、多样性好的优势,可广泛用于人源靶点治疗及诊断抗体筛选。但由于天然抗体库中抗体序列多来自IgM,未经刺激成熟,体内亲和力较IgG型偏弱。将获得的scFv序列组装至IgG全长后,亲和力通常为10~(-7)至10~(-8) M级,难以满足对亲和力要求较高时的需求。本论文通过针对不同的靶点的结构特征、项目需求进行抗体淘选和筛选实验。首先,抗原分别选取细胞表面胞外区蛋白、多跨膜蛋白、人源抗原和鼠源抗原,进行直接法和间接法Elisa实验,优化抗体的检测方法。其次,淘选阶段选取不同的结合形式,分别选取固相筛选、液相筛选、细胞筛选和高通量仪器进行淘选,并选取不同的抗原筛选起始浓度,对比Output抗体序列的数量和阳性率,优化淘选方法。其三,在筛选阶段通过优化Elisa形式、缓冲液类型和试剂浓度等方式,增加抗原与噬菌体颗粒之间的检测窗口,提高阳性数值,减少假阳性。通过这一系列的优化手段,最终获得多个满足需求的高亲和力抗体(10~(-9)至10~-1010 M)。这些淘选和筛选方法的优化研究,有利于提高最终抗体的阳性率和多样性,为利用噬菌体展示抗体库高通量筛选获得目标抗体提供了方法学上的参考。
【学位单位】:上海交通大学
【学位级别】:硕士
【学位年份】:2018
【中图分类】:R392
【部分图文】:

结构图,丝状噬菌体,复制过程,拷贝数


丝状噬菌体复制过程和结构图

示意图,示意图,噬菌体,衣壳


体的两边基因为线形、双链开链结构,其末端带有 12 个左单链 DNA 构成[7,10,11]。T4 噬菌体展示系统也是一种较为系统[12]。它的主要特点是衣壳蛋 S℃和 H℃的 C 端中能够白分别融合,从而展示于 T4 噬菌体的表面,故而蛋白纯会因为复杂的纯化手段而导致蛋白失活和变性。T7 噬菌体于其他体系,发展的较晚。T7 展示系统的衣壳蛋白有 10A式,一般会情况下会采用 10B 衣壳蛋作为表达和融合外源。T7 噬菌体的一个主要特点是生长周期比较快,节省了时蛋白大小范围广,可多表达 50 多个氨基酸的多肽片段,酸的蛋白。T7 噬菌体整体的耐受性较强,耐酸、耐碱、件下较为稳定,非常利于筛选不同条件下和环境下的目标本身活性。

示意图,噬菌体抗体库,示意图


上海交通大学硕士学位论文的表达水平,HuCAL-PANTINUM 的总库容达到 4.5×1010,正确率超过 70文献报道的库容最大,正确率最高的抗体库。混合库是指将分别构建的各类抗体库(包括天然抗体库,合成抗体成抗体库)中的 2- 3 种不同的类型的各类子库混合在一起构建而成的新型混合库的有点,有天然库及半合成抗体库的特点,提高抗体库的多样性用性。理论上筛到各种抗原结合的特异性抗体。

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本文编号:2820379

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