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家猪凝血相关因子的遗传分子研究

发布时间:2019-08-01 09:45
【摘要】: 家猪由于资源丰富、成本低廉和在伦理学、种间传播疾病等方面的明显优势已经广泛应用于生物医学研究的各个领域。将猪作为器官供源的猪到人异种移植是缓解目前供器官严重短缺的有效途径,临床器官供求关系的持续紧张和近10年来异种移植研究的快速发展都迫切需要对家猪的基因组、蛋白质组等遗传学问题进行更深入广泛的研究来推动异种移植发展和开拓家猪的医学应用前景。 αGT基因敲除猪和人补体调节蛋白转基因猪的培育成功有效解决了异种移植中首先面临的超急性排斥反应,在急性血管性排斥阶段,以微血管血栓为主要表现的凝血紊乱成为又一个导致供器官失功,阻碍异种移植发展的难题。在引起异种移植中凝血紊乱的主要原因中,除了免疫排斥引起的内皮细胞损伤、激活外,另一个重要原因就是猪内皮细胞表面的抗凝分子和人血循环中的凝血因子之间功能不匹配,使抗凝减弱而促凝增强。此外,猪到人肝脏移植后,猪肝脏合成异种凝血、抗凝、纤溶因子能否替代人源蛋白在人体内发挥正常的生理功能,能否与人内皮细胞和外周血中的凝血调节分子相互作用保证机体正常的血流和止血都是异种移植真正走向临床需要解答的问题。对家猪凝血系统的遗传特征和生理功能研究是探索异种移植中凝血紊乱机制和功能匹配问题的前提,也为寻找可能的基因改造途径奠定基础。 版纳微型猪近交系(Banna Minipig Inbred line,BMI)是云南农业大学曾养志教授经过20多年连续同胞交配或半同胞交配培育成功的世界唯一的高度近交小型猪种,在生物医学和异种移植研究中都有重要的应用价值。本研究以BMI为研究对象,成功构建了肝脏组织cDNA表达文库。文库鉴定结果显示初级文库的滴度为0.70×10~6pfu,重组率为96.6%,库容量为1.05×10~6pfu;扩增文库的滴度为4.87×10~9,重组率为97.5%。文库随机克隆的插入片段长度平均在1200bp。该文库在复杂度、完整性等方面都达到了后续基因研究的要求。 为了解BMI肝脏基因表达谱的特征,我们挑选了200个cDNA文库随机克隆进行单向测序,获得192条有效EST序列。BLAST程序比对结果显示,其中89个克隆的插入序列与数据库中已有的猪基因匹配,包括一些重要的肝脏功能基因,如白蛋白、细胞色素、载脂蛋白等;70个克隆的插入序列与已知猪基因无匹配,但和其他哺乳动物序列有高度同源性,可能为未知的家猪相应基因序列;另33个序列与核酸数据库中基因无匹配,为新发现的家猪EST序列。将得到的EST序列及翻译后的蛋白质序列与人相应序列进行同源比对显示了较高的同源性,但少数基因如carbamoyl-phosphate synthetasel基因、cytochrome c oxidase subunit 1、3、基因和catalase基因没有发现人的同源基因,推测可能是猪进化中特有基因。从序列比对中还发现,在这些EST序列中,22个含有完整的读码框,38个有完整的5’末端序列,140个有完整的3’末端序列。 凝血因子(coagulation factor,CF)Ⅱ、Ⅶ、Ⅹ,抗凝血酶Ⅲ(antithrombinⅢ,AT-Ⅲ)和纤溶酶原(plasminogen,PLG)是凝血、抗凝和纤溶系统中的重要因子,目前猪的这些基因序列都还未见报道。我们通过噬菌斑杂交方法和PCR方法筛选BMI肝脏cDNA文库得到插入有目的基因的阳性克隆,再结合5'RACE末端扩增技术,得到BMI CFⅡ、CFⅦ、CFⅩ、AT-Ⅲ的全长cDNA;通过电子克隆方法得到BMI PLG的全长cDNA。测序结果显示,克隆得到BMI CFⅡ全长cDNA 2027bp,CFⅦ1416bp,CFⅩ1856bp,,AT-Ⅲ1498bp,PLG 2768bp。以上序列均提交GenBank,获得基因登记号分别为:DQ530370、DQ530371、DQ530372、DQ530373、DQ5303704。 在得到克隆的新基因序列后,我们利用生物信息学方法对BMI CFⅡ、CFⅦ、CFⅩ、AT-Ⅲ、PLG核酸及蛋白质序列进行了初步分析,通过与人相应序列的同源性比对和蛋白质模拟三维结构的比较,初步分析了猪与人凝血因子的相似性和可能存在的差异。结果显示:和人相应基因比较,BMI CFⅡ、CFⅦ、CFⅩ、AT-Ⅲ、PLG的核酸序列同源性分别为83.84%、78.34%、79.81%、87.67%、80.21%;蛋白质序列同源性分别为83%、74.08%、73.10%、89.06%、80.67%;序列比对提示所有的半胱胺酸位点在不同物种间都高度保守;主要催化活性位点在序列和空间位置上也都高度保守;猪和人相应蛋白质的三维结构中,蛋白骨架的空间构相都非常相似。提示这些凝血因子在猪和人之间可能具有相似的生理功能和催化活性,但是在一些特殊位点的序列差异可能造成空间构相和空间位阻的变化,在和底物结合以及其他大分子结合的能力上产生差异。 此外,我们还初步探索了BMI CFⅡ基因的体外蛋白表达方法。分别构建了重组CFⅡ的原核表达载体PET22b-cfⅡ、毕赤酵母表达载体pPIC-9K-cfⅡ和真核细胞表达载体pcDNA3.1~+-cfⅡ。在原核表达中目标蛋白主要以包涵体形式诱导表达。在毕赤酵母表达过程中,在筛选得到的His+和Geneticin+重组克隆诱导培养上清中检测到了目标蛋白的存在,但结果提示表达量很小,培养上清用二期法未检测到cfⅡ活性。真核细胞表达过程中,经G418抗性筛选得到了含有pcDNA3.1~+-cfⅡ的重组CHO细胞株。但在重组细胞的培养上清中未检测到目的蛋白的表达。CFⅡ是一种分子量较大的真核蛋白,空间结构复杂,需要经过复杂的翻译后修饰过程,所以体外表达难度较大。建立有效的凝血因子体外表达系统还需更多的实验摸索。 综上所述,本研究成功构建了版纳微型猪近交系(BMI)肝脏cDNA表达文库;并初步研究BMI肝脏基因表达谱特征,鉴定得到了多个家猪新基因EST序列;克隆得到了重要的凝血相关因子CFⅡ、CFⅦ、CFⅩ、AT-Ⅲ和PLG的全长cDNA序列;通过生物信息学分析初步比较了BMI凝血因子与人的差异;并对体外表达凝血因子方法进行了初步探索,为今后对家猪凝血相关因子进行功能学研究,探索异种移植中凝血紊乱的分子机制和肝脏功能匹配问题奠定了基础,也为寻找家猪凝血系统的基因改造靶点,提供了分子遗传基础。
【图文】:

家猪凝血相关因子的遗传分子研究


四川大学博士学位论文图1一l:BMI肝脏总RNA琼脂糖电泳。左为 RL6000RNAmarker,右为BMI总RNA,255亮度是255的两倍以上。F三9.1一 1:AgarosegelelectrOPhoresisoftatolRNAofBMI Iiverdssue.Therightlane151林 9totalRNA, andthebandsof285, and185areindieated.Theleftlane15RNAmarkerRL6000.﨑一

本文编号:2521673

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