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CLN8P相互作用蛋白质筛

发布时间:2019-08-01 12:50
【摘要】:第一部分 CLN8P相互作用蛋白质的筛选 目的 CLN8是神经元蜡样脂褐质沉积症(the neuronal ceroid lipofuscinoses,NCLs)这一疾病群中的一个致病基因。关于其功能知之甚少。我们采用酵母双杂交技术。筛选人胎脑cDNA文库表达产物中与CLN8P相互作用的分子,初步探讨CLN8P的功能,为其在发病机制中的作用提供新线索。 方法 将CLN8构建到酵母双杂交系统中的pLexA载体,检测该重组质粒对报告基因LacZ的自激活作用。通过酵母双杂交方法,从人胎脑cDNA文库表达产物中筛选与CLN8P相互作用的分子,提取阳性克隆质粒DNA,进行测序及生物信息学分析。 结果 成功构建酵母双杂交系统plexA-CLN8诱饵质粒,诱饵质粒对报告基因LacZ无自激活作用,筛选到41个阳性克隆。序列测定表明,其中有一个阳性克隆编码人NADH脱氢酶亚单位5。 结论 1、CLN8P与ND5在酵母细胞中有相互作用。 2、ND5与CLN8P结合,可能是造成脂褐质线粒体ATP合酶亚基C积聚的新机制之一。 第二部分 CLN8基因真核表达载体构建及检测 目的 构建真核表达载体,为在哺乳动物细胞内验证CLN8与ND5是否存在相互作用奠定实验基础。 方法 采用PCR技术扩增CLN8基因,将其亚克隆到P-Flag真核表达载体,在HeLa细胞中表达,对表达产物进行Western blot鉴定。 结果 特异扩增CLN8基因编码序列,构建了真核表达载体P-Flag-CLN8,在HeLa
【图文】:

CLN8P相互作用蛋白质筛


和分析建酵母双杂交系统诱饵质粒p1xeA一1ns1PCR扩增c1ns基因片段行设计引物,扩增出带有所设计酶切位点的clns基因片段。l%琼果显示与预期值86lPb相符(图)l。重组质粒plxeA--C!n8的酶切鉴定组质粒pelAx‘In8用EocRI和众01双酶切后,得到两个D为10.2kb和gooPb,,小片段大小与PCR扩增产物一致,大片段大小片段一致,这些均与预期值相符(图2)。M12

CLN8P相互作用蛋白质筛


分析实验发现,转化有阳性质粒的酵母克对照质粒pelAx一os激活下游报告基因LX一gal,因而菌落变蓝。而阴性对照以及构建色(图4),表明构建的诱饵质粒对报告基
【学位授予单位】:南华大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:R346

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 徐东刚;酵母双杂交系统的应用研究进展[J];国外医学.临床生物化学与检验学分册;2001年06期

2 袁云,陈清棠;神经蜡样质脂褐素沉积病[J];中华儿科杂志;2002年10期



本文编号:2521763

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