当前位置:主页 > 医学论文 > 病理论文 >

重组sCD83和sBTLA对DC活性及sCD83对同种皮肤移植物存活的影响

发布时间:2019-09-11 20:48
【摘要】: 一、前言 移植排斥反应是导致临床同种移植术失败的主要原因。一般认为,T细胞应答及其效应是介导移植排斥反应发生的主要机制。双信号假说认为T细胞活化需两个信号:信号1由TCR识别APC表面的抗原肽-MHC复合物(p-MHC)所启动;信号2由T细胞和APC间共刺激分子的相互作用所启动。两个信号的整合可最有效地诱导T细胞活化,而缺乏共刺激信号可致T细胞应答下降,某些情况下可诱导耐受或T细胞失能(anergy)。 近年来,对共信号分子(co-signalling molecule)的研究不断深入,并对双信号学说形成挑战。Chen Lieping提出T细胞活化的共信号网络学说,其要点是:虽然TCR信号是T细胞活化所必需,但并不能决定T细胞活化的方向,而共信号(共刺激信号和/或共抑制信号)才是引导抗原特异性T细胞应答的关键。根据该理论,阻断T细胞活化的共刺激信号或增强共抑制信号,均可负调节T细胞活性,从而诱导T细胞产生免疫耐受。 抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC)介导的抗原提呈是T细胞识别同种抗原的关键环节。目前认为,树突状细胞(dendritic cell,DC)成熟状态在T细胞识别同种抗原中起重要作用,并直接影响免疫应答的强度和类型:成熟DC表面表达多种共刺激分子(如CD80、CD86、CD40等)、黏附分子(如CD54、CD58等)和MHCⅠ和Ⅱ类分子,,其功能主要是诱导免疫应答;未成熟DC低表达共刺激分子、黏附分子和MHC分子,其诱导T细胞激活的能力很弱,可能在免疫耐受形成中发挥重要作用。 CD83属免疫球蛋白超家族,与B7家族成员具有一定同源性,是成熟DC的表面标志,其生物学功能尚未完全清楚。已发现,伴随DC成熟,其表面CD83与其他共刺激分子(CD80、CD86)的表达亦升高,提示CD83具有重要生物学功能。文献报道,CD83在T细胞成熟和活化中起重要作用,其实验依据为:①可溶性CD83可抑制T细胞活化,提示CD83可能是参与T细胞活化的共刺激分子之一;②可溶性CD83可抑制DC表达共刺激分子,并下调DC的共刺激活性,从而抑制DC对T细胞的活化。 BTLA(B and T lymphocyte attenuator,BTLA)是最近发现的CD28家族成员,与该家族另两个抑制性受体(CTLA4、PD1)有相似分子结构。研究发现,BTLA参与维持自身耐受,并是下调Th1细胞活性的重要因子,相关实验依据为:①BTLA主要表达于活化的T和B细胞表面,尤其持续高表达于Th1细胞表面;②BTLA缺陷动物易诱发EAE。最近发现,“疱疹病毒进入介质”(herpesvirus entry mediator,HVEM)是BTLA的配体,BTLA结合HVEM的部位与LIGHT不同,但与疱疹病毒糖蛋白D(Herpesvirus glycoprotein D,gD)的结合部位相重叠。已证实,HVEM与T细胞表面BTLA结合,可启动正向信号而抑制T细胞活化,其机制尚不清楚。有关HVEM-BTLA途径介导反向信号对HVEM表达细胞的影响,迄今尚未见报道。 鉴于可溶性CD83具有抑制T细胞增殖和抑制DC共刺激活性的双重作用,本课题探讨可溶性CD83延长同种皮肤移植物存活的作用,并初步探讨其机制,以期为将CD83应用于临床治疗移植排斥反应提供理论和实验依据。 另外,本研究克隆小鼠BTLA基因,探讨HVEM-BTLA反向信号对DC表达共刺激分子的影响,为将BTLA作为抗移植排斥反应的分子靶点提供理论和实验依据。 二、小鼠CD83、BTLA和人IgG1αFc基因克隆和真核表达载体构建 采用TRIzol试剂提取小鼠脾脏和人外周血单个核细胞总RNA,经RT-PCR扩增小鼠CD83和BTLA基因以及人IgGlαFc(hIg)基因,并克隆至pcDNA3.1(+)载体中。构建pmCD83-hIg和pmBTLA-hIg表达载体,经酶切和DNA序列测定鉴定,结果表明:成功克隆了小鼠CD83、BTLA胞外功能区基因和hIg基因,成功构建了表达小鼠CD83或BTLA胞外功能区与人IgGlαFc融合蛋白(mCD83-hIg或mBTLA-hIg)的真核表达载体。 三、可溶性mCD83-hIg的制备及生物学功能的研究 采用Lipofectamine ~(TM)2000将pmCD83-hIg载体转染COS-7细胞,在COS-7细胞中表达可溶性mCD83-hIg融合蛋白;采用Western blot、ELISA检测COS-7细胞培养上清中所表达的mCD83-hIg融合蛋白,并用人IgG作为标准品对mCD83-hIg进行定量检测;采用RT-PCR检测mCD83-hIg融合基因mRNA表达。结果表明:转染pmCD83-hIg的COS-7细胞培养上清液可与抗小鼠CD83抗体形成明显条带,其分子量约39.8kD,与预期结果相一致;转染后前4天细胞培养上清中融合蛋白表达量增高较快,但5~7天仅有轻度增高,最高达380μg/L;转染pmCD83-hIg的COS-7细胞可表达mCD83-hIg融合基因mRNA,在约120bp处呈现一明显条带,与预期结果一致。 采集转染pmCD83-hIg的COS-7细胞培养上清液,借助Protein A shepharose CL-4B亲和层析柱纯化mCD83-hIg融合蛋白;经浓缩透析,借助SDS-PAGE鉴定融合蛋白纯度,纯化的融合蛋白在约39.8kD处形成一条带,提示纯化蛋白纯度较高,可用于后续实验研究。 借助倒置显微镜观察小鼠DC细胞系(DC2.4)形态;FCM鉴定其表面标志。结果显示:DC2.4呈典型树突状细胞形态,表面高表达CD83、CD80和CD86,表明DC2.4为成熟的小鼠DC,可作为DC研究的细胞模型。 将mCD83-hIg加入到DC2.4培养体系中,72小时后应用PI染色,FCM检测DC细胞周期和细胞凋亡,并检测DC表面共刺激分子表达、IL-12产生及其刺激同种T细胞活化的能力。结果显示:mCD83-hIg对DC2.4细胞周期和细胞凋亡无影响,但可下调CD83、CD80和CD86表达,显著抑制LPS刺激的IL-12产生,并显著抑制DC2.4的共刺激活性。 分离BALB/c小鼠脾脏T细胞作为反应细胞,C57BL/6小鼠脾细胞作为刺激细胞,进行单向MLR,以检测mCD83-hIg对同种T细胞增殖的影响。结果发现:mCD83-hIg可显著抑制T细胞增殖,抑制IL-2和IFN-γ产生,并呈剂量依赖性,但对IL-4和IL-10产生无影响。 以上结果说明:可溶性mCD83-hIg可抑制DC表面共刺激分子表达,抑制LPS诱导的IL-12产生,从而抑制DC的共刺激活性;可溶性mCD83-hIg也可抑制T细胞增殖和产生IL-2、IFN-γ。因此,可溶性CD83可分别作用于DC和T细胞,从而对T细胞应答发挥双重调节作用。 四、mCD83-hIg延长同种皮肤移植物存活时间的实验研究 建立小鼠同种皮肤移植模型。在皮肤移植前1天、移植后第1天和第3天,分别用可溶性mCD83-hIg处理皮肤移植受者,观察皮肤移植物存活时间,并以人IgG和PBS作为对照。结果发现:mCD83-hIg处理组移植物平均存活时间为(12.57±2.07)天,人IgG对照组为(8.57±1.51)天,PBS对照组为(8.71±1.11)天,mCD83-hIg处理组皮肤移植物存活时间显著长于对照组(P<0.01)。 移植后第7天,取移植皮片进行组织学分析,并借助RT-PCR检测某些细胞因子mRNA表达;取受者外周血检测血清某些细胞因子水平;取供者脾细胞再次刺激受者脾脏T细胞,检测后者对供者同种抗原的再次应答能力。结果发现:①mCD83-hIg处理组皮肤移植物中炎性浸润明显低于对照组,对照组皮肤移植物中有较多炎性细胞浸润,主要为单个核细胞,且毛细血管严重充血,出血,组织出现小溃疡灶;②mCD83-hIg处理组皮肤移植物中炎性细胞因子IL-2和IFN-γmRNA表达显著低于对照组(P<0.01或P<0.05),但各组间IL-4和IL-10mRNA表达无差异;③mCD83-hIg处理组受者血清IL-2和IFN-γ水平也显著低于对照组(P<0.01),各组间血清IL-4和IL-10水平亦无有差异;④mCD83-hIg处理组受者脾脏T细胞对供者脾细胞再刺激的增殖活性显著低于对照组。 以上研究结果表明:可溶性CD83在体内可抑制同种T细胞活化,抑制Th1型细胞分化和细胞因子产生,从而延长同种皮肤移植物存活。提示:可溶性CD83在治疗移植排斥反应中可能具有较好应用前景。 五、重组GST-mBTLA融合蛋白的表达及抗血清的制备 构建谷胱甘肽-S-转移酶—小鼠BTLA胞外功能区融合基因(GST-mBTLA)的重组质粒:在E.coli BL21(DE3)中表达重组GST-mBTLA融合蛋白;借助Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化重组蛋白,经SDS-PAGE鉴定,纯化的重组蛋白达到电泳纯;将重组蛋白免疫家兔,制备兔抗GST-mBTLA血清,其双扩散效价为1:16,ELISA效价为1:3200。 六、可溶性mBTLA对DC表面共刺激分子表达的影响 将pmBTLA-hIg载体转染DC2.4细胞,筛选稳定表达细胞株。采用Western blot、ELISA检测细胞培养上清中mBTLA-hIg融合蛋白含量,并用人IgG作为标准品定量检测mBTLA-hIg;借助RT-PCR检测mBTLA-hIg融合基因mRNA表达。结果表明:稳定转染pmCD83-hIg的DC2.4细胞培养上清液可与抗mBTLA抗体形成明显条带,其分子量约43.3kD,与预期结果相一致:1×10~4pmBTLA-hIg稳定转染的DC2.4,(在2.5ml培养基中)所分泌mBTLA-hIg融合蛋白水平呈时间依赖性,最高达230ug/L;借助RT-PCR,证明转染pmBTLA-hIg的DC2.4可表达mBTLA-hIg融合基因mRNA,在约175bp处呈现一明显条带,与预期结果一致。 将稳定表达mBTLA-hIg的DC2.4培养72小时,经PBS洗涤,用FITC标记的抗人IgG1单抗染色,借助FCM检测细胞表面是否结合mBTLA-hIg。结果表明:稳定表达mBTLA-hIg的DC2.4能与FITC标记的抗人IgG1抗体结合,说明mBTLA-hIg可结合到DC2.4表面;借助FCM分析稳定表达mBTLA-hIg的DC2.4表面共刺激分子表达,发现CD80表达高于未转染细胞,而CD86表达低于未转染细胞;将GST-mBTLA融合蛋白加入未转染DC2.4培养体系中,借助FCM检测共刺激分子表达,发现GST-mBTLA融合蛋白可上调DC2.4表面CD80表达,并呈剂量依赖性,但GST-mBTLA对DC2.4表面CD86表达无影响。进一步在DC培养体系中加入兔抗小鼠GST-mBTLA血清,检测抗血清的阻断效应,结果发现:可溶性mBTLA对DC表面共刺激分子表达的影响可被兔抗小鼠GST-mBTLA血清所阻断。 上述结果说明:可溶性mBTLA可调节DC表面共刺激分子表达,即可调节DC的共刺激活性,该效应可能是HVEM-BTLA反向信号作用于DC的结果。进一步研究BTLA对DC生物学行为的影响及其分子机制,不仅具有重要理论意义,也可望为探寻干预免疫相关疾病的策略提供理论和实验依据。 七结论 1.可溶性CD83的生物学效应为:①下调DC表面共刺激分子表达和IL-12产生,从而抑制DC的共刺激活性;②通过抑制T细胞增殖、Th1型细胞分化和细胞因子产生,从而在DC和T细胞两个调节点对免疫应答起负性调节作用。 2.给予可溶性mCD83-hIg可延长小鼠同种皮肤移植物存活时间,提示其可能是一种有效的免疫抑制剂,并可望在治疗移植排斥反应和自身免疫病中具有应用前景。 3.可溶性mBTLA可调节DC表面共刺激分子表达,该效应可能是HVEM-BTLA途径反向信号作用的结果。
【图文】:

序列,基因克隆,同济,博士学位论文


华中科技大学同济医学院博士学位论文见图1一5一8,mcD83ext插入PcDNA3.1一hlg后采用T7和sP6通用引物测序,证明mCD83的序列与Genebank中所公布序列完全一致 (NM009856)。ABbpbpp皿b加1000750500 111069715000100007弓00500025001000413250图1一 4mCD83基因克隆和pmCn83一hlg载体构建Figl一 3AmPlificationofmurineCD83genebyRT一 PCRandconstruetionofPmCD83一 hlgreeombinantveetor A:eDNAofmurineCD83amPlifiedfrommousesPleenbyRT-PCR.PCRProduetionofmurine CD83wasan806bPfragement.B:IdeniificationofPmCD83一 hlgreeombinantveetorbythe restrictionendonucleasedigestion.l:PmCD83一 hlgdigestedbyHindlllonly;2:PmCD83一hlg digestedbyHindlll/B翩Hl, releasea413bPfragementofCD83ext:3:PmCD83一hlgdigestedbyBamHI/Xbal, releasea697bPfragmentofhlgFe;4:PmCD83一 hlgdigestedbyHindlll/乃al, releasea1110bPfragmentofmB7h3一 hlg;M:DNAmarker.

序列,基因克隆,序列,PCR技术


2.采用PCR技术自pGEMT-mBTLA质粒中扩增 mcD83extDNA,并克隆至PcDNA3.1一Mg载体的hlg上游,分别经Hin班Il/B“mHI、B“mHI/乃clI和Hindlll/乃aI双酶切鉴定,结果酶切片断大小和预期结果一致(图1一9一B)。序列测定结果显示,克隆的mBTLA序列与Geneballk中所登录的小鼠BTLA序列(AY293285)完全一致(图1一10)。ABBTLA五任 1234MbP9171000500图1一 9mBTLA基因克隆和载体构建鉴定Figl一 9AmPlifieationofxnouseBTLAgenebyRT一 PCRandconstructionofPmBTLA一 hlgrecombinantvector A:cDNAofmouseBTLAamplifiedfrommousesPlenieeellsbyRl’ -PCR, BTLA:PCRProduction ofmouseBTLA;M:DL20OODNAmarker.B:IdentifieationofPmBTLA一 hlgrecombinantveetor bytherestrietionendonueleasedigestion.1:PmBTLA一 hlgdigestedby关刀力 dlllonly;2:PmBTLA一 hlgdigestedbyHin班11/乃al, releasingafragmentof1228bPcontainingBTLAand hlgFe:3:PmBTLA一 hlgdigestedbyBamHI/乃al, releasingafragmentof697bPofhlgFc:4:PmBTLA一 hlgdigestedbyHindlll/BamHIreleasingafragmentof531bPofB丁’LA;M:DNA markerIV‘
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:R622;R392

【引证文献】

相关硕士学位论文 前1条

1 李坤;人可溶性CD83基因的克隆、原核表达、纯化及其融合蛋白活性检测[D];第四军医大学;2008年



本文编号:2534654

论文下载
论文发表


    下载步骤:
    1.微信扫码,备注编号 2534654.
    2.
    点击下载


    本文链接:http://www.bigengculture.com/yixuelunwen/binglixuelunwen/2534654.html