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延边黄牛和韩延牛血液外胞体中miRNA的差异表达分析

发布时间:2020-06-30 19:56
【摘要】:外胞体(Exosome)中的miRNA具有调控动物生长的功能,miRNA(microRNA)是一类长度约为22nt的非编码的小分子RNA,其可通过靶向降解mRNA或抑制蛋白的翻译在动物生长发育过程中发挥着重要的作用。本试验为进一步探讨Exosome中miRNA对延边黄牛生长发育的调控机制,从延边黄牛和韩延牛血液Exosome中分离miRNA,通过RNASEQ测序和生物信息学技术分析延边黄牛及韩延牛血液Exosome中miRNA的表达特点。试验结果如下:1、对延边黄牛和韩延牛的血液Exosome中的总RNA进行提取并进行纯度和质量检测。结果显示,获得的总RNA主要为RNA为5S,表明获得的总RNA样品完整性较好。在260nm和280nm下的OD值为1.8-2.2,说明所提取的RNA质量较好,无其他杂质,符合试验要求可用于后续分析。2、分别对延边黄牛与韩延牛的血液Exosome中的小RNA进行测序,结果表明,延边黄牛血液Exosome的小RNA文库共获得18551862条原始序列;韩延牛血液Exosome的小RNA文库共获得17203718条原始序列,碱基错误率较低,测序质量较高。原始序列数据过滤结果表明,在延边黄牛血液Exosome中的clean reads所占的比例为93.09%;韩延牛血液Exosome中clean reads所占比例为82.74%。检测质量80%,符合测序要求。3、对延边黄牛与韩延牛的血液Exosome中小RNA样品的纯净序列进行了核苷酸长度统计分析。结果表明,延边黄牛和韩延牛血液Exosome中小RNA序列长度主要分布在17-30 nt。4、miRNA的鉴定结果表明,延边黄牛血液Exosome中已知miRNA为912条,新发现的miRNA为115条;韩延牛血液Exosome中已知miRNA为905条,新发现的miRNA为317条。新miRNA预测结果表明,在两个品种中一共检测到187个新miRNA,其中延边黄牛中有41个新miRNA,韩延牛中有146个新miRNA。5、miRNA差异表达分析结果表明,在延边黄牛和韩延牛中获得差异表达miRNA有524个,其中上调表达的271个,下调表达的253个。已知miRNA382个,新 miRNA 142 个。6、差异表达miRNA的靶基因结果表明,在两个品种牛中共预测到52348个靶基因。GO富集分析可知,这些靶基因被富集到3473条生物学过程,394条细胞组分以及879条分子功能。KEGG分析可知,这些预测得到的miRNA的靶基因总共被注释到326条信号通路中,最显著富集的通路为mTOR信号传导通路。综上所述,我们获得了在韩延牛和延边黄牛血液Exosome中差异表达的miRNA种类,并对差异表达miRNA的靶基因进行了预测分析及GO和KEGG分析,为下一步将选取关键差异表达miRNA研究相关miRNA如何通过关键信号通路调控延边黄牛和韩延牛生长发育调控的,从而在分子水平上探讨影响边黄牛和韩延牛生长发育差异的机制提供了试验基础。
【学位授予单位】:延边大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S823
【图文】:

流程图,实验操作,流程图,文库


)小邋RNA邋的邋cDNA邋文库建立:利用邋First邋Strand邋Master邋Mix邋and邋Super邋Scrip(Invitrogen)对(3)步骤获得的连接产物先进行反转录反应,反应5°C,lOmin邋;邋48°C,3min;邋42°C,lh;邋70°C,邋15min。然后对获得物利用PCR尾巴引物和PCRMix进行PCR扩增,反应条件为:98°C下进行一个循环,接着在98°C,15邋s,72°C,邋15邋s条件下进行15个循环2°C,lOmin条件进行一个循环,最后4°C保存,获得cDNA文库。逡逑)逦PCR产物的纯化:使用15°/0TBE的PAGE胶对PCR产物进行切胶回收产物溶于EB邋solution。最后贴上标签,至此文库构建完成,用于定。逡逑)文库质量检测:将构建好的文库使用Agilent邋2100邋Bioanalyzer和ABPlus邋Real-Time邋PCR邋System进行质量和产量的检测。逡逑iRNA测序文库的构建具体流程如图1所示。逡逑

电泳图,测序,完整性检测,血液


RNA主要为5S和少量的18S,而经DNase消化后,电泳显示条带与未处理时相逡逑同。但经RNase处理后,样品内的RNA完全被消化,电泳图内未显示有任何条逡逑带(图3)。样品RNA完整性检测结果表明,其主要RNA为5S邋(图4),说明逡逑提取的RNA降解程度较低,完整性较好,无其杂质污染,可用于后续研宄。逡逑对提取的总RNA使用核酸蛋白测定仪测定,结果显示,在260nm和280nm逡逑下的OD值为1.8-2.2,此结果说明所提取的RNA质量较好,无其他杂质,符合逡逑试验要求能够用于进一步的测序分析。逡逑1邋2邋3逡逑■逦PU]邋j逦5S逡逑:丨:L_j逡逑〔|_邋V逦...邋■邋I邋.MU邋I邋—邋-邋1邋111邋1邋<!■逡逑L_1邋I ̄ ̄I邋I邋I邋I逡逑一邋RNase逦25邋200邋1000邋40oo逦[mj逡逑七邋DNase逡逑M:DL2000邋Marker;邋1-3:血液邋Exosome邋总邋RNA逡逑图3总RNA电泳检测逦图4总RNA完整性检测逡逑Fig.邋3邋Total邋RNA邋electrophoresis邋detection逦Fig.邋4邋Total邋RNA邋Integrity邋Testing逡逑2邋miRNA测序结果逡逑2.1测序数据质量逡逑本试验通过深圳华大基因公司High-seq测序平台分别对延边黄牛(YBYC)逡逑与韩延牛(HYC)的血液Exosome中小RNA进行了测序,测序产生数据如表1逡逑17逡逑

【参考文献】

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本文编号:2735751

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