当前位置:主页 > 医学论文 > 畜牧兽医论文 >

犬瘟热病毒单克隆抗体的筛选与双抗体夹心ELISA的建立

发布时间:2020-10-17 04:22
   犬瘟热(canine distemper,CD)是由犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)引起的一种病毒性传染病,在全世界范围内广泛发生。其传统宿主主要包括大部分食肉目动物。CDV感染犬科、猫科、浣熊科、鼬科、小熊猫科、大熊猫科已被多次报道。截至2013年年底,全国野生大熊猫种群数量达1864只,圈养大熊猫种群数量达到375只。2014年12月至2015年4月,陕西省珍稀野生动物抢救饲养研究中心22只大熊猫中先后有6只CDV核酸检测阳性,并且5只抢救无效相继死亡。目前,RT-qPCR和胶体金试纸条是犬瘟热最常用的检测手段,但是RT-qPCR成本高、技术复杂、容易污染。而胶体金试纸条大多是针对感染犬的犬瘟热病毒,并没有针对犬瘟热的试纸条。因此,有必要建立一种敏感性强且特异性好的犬瘟热病毒检测技术,从而能够准确、快速地诊断感染大熊猫的犬瘟热病毒,对保护我国珍稀动物有着重大意义。本实验构建了犬瘟热病毒楼观台毒株F蛋白的原核表达质粒,表达了犬瘟热病毒融合蛋白胞外区,以此作为抗原,制备了针对犬瘟热病毒的单克隆抗体,然后用HRP标记单克隆抗体,建立了针对犬瘟热病毒双抗体夹心ELISA方法。其结果如下:1.犬瘟热病毒重组F蛋白的原核表达与纯化参照犬瘟热病毒楼观台毒株F蛋白的基因序列,构建了包含犬瘟热病毒F蛋白胞外区的重组质粒,转化大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3),在37℃,1 mmol的IPTG的条件下诱导6 h,超声裂解大肠杆菌,然后经过Ni Resin亲和层析,通过SDS-PAGE与Western Blot分析,CDV-F蛋白成功表达,得到预期大小为40 Kda蛋白,并且表达的CDV-F蛋白具有良好的反应原性,用经纯化的CDV-F蛋白免疫小鼠,通过采集小鼠血清进行间接ELISA分析,小鼠血清的抗体滴度达到10~(-5),说明原核表达的CDV-F蛋白具有良好的免疫原性。2.单克隆抗体的制备、纯化与HRP标记用纯化的CDV-F作为抗原,免疫BALB/c小鼠,利用传统的细胞融合与亚克隆技术成功制备了三株单克隆抗体1A5,1A5和7D5,通过向腹腔注射杂交瘤细胞制备单克隆抗体,收集腹水通过Protein G亲和层析进行纯化,浓度分别为1.2 mg/mL,1.2 mg/mL,1.8 mg/mL。然后用氧化还原法标记HRP,直接ELISA方法检测三株抗体的效价为1∶100000-1∶1000000。3.犬瘟热病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立首先利用犬瘟热病毒作为抗原,通过竞争ELISA对单克隆抗体抗原表位进行分析,结果显示,三株单克隆抗体均识别不同的表位,通过捕获抗体与检测抗体的确定,结果显示1A5作为捕获抗体,7D5-HRP作为检测抗体时检测病P/N值最高,非特异性反应最弱,然后通过棋盘滴定法确定了双抗体夹心ELISA方法的最佳反应条件,其中捕获抗体包被量为800 ng/孔、HRP-7D5稀释比例为1∶100。4.敏感性评价:用现有的商品化试纸条与双抗体夹心ELISA方法分别犬瘟热病毒感染的vero细胞的上清。结果显示,两种方法均能检测到logTCID_(50)=1.8的病毒样本,上述结果说明,建立的双抗体夹心ELISA方法的敏感性与现有的商品化试纸条相同。5.特异性评价:利用CPV(犬细小病毒)、ICHV(犬传染性肝炎病毒)、CPIV(犬副流感病毒)三种病毒感染细胞的上清来评价双抗体夹心ELISA方法的特异性。结果显示,CPV、ICHV、CPIV细胞培养的上清均不反生反应,因此本方法具有良好的特异性。6.与商品化试纸条一致性评价:13份临床大熊血清与30份临床犬血清分别用商品化试纸条与建立的双抗体夹心ELISA方法检测,临床大熊猫血清中均没有检到犬瘟热病毒,临床犬血清两种方法均检到6份阳性,两种方法的一致性为100%,说明双抗体夹心ELISA方法与现有的商品试纸条一致性高。综上所述,本课题建立了一种快速检测犬瘟热病毒的双抗体夹心ELISA方法,与商品化试纸条具有很高的一致性,可以用来检测犬瘟热病毒。
【学位单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:硕士
【学位年份】:2019
【中图分类】:S852.4
【部分图文】:

电泳图,F基因,截短,PCR扩增产物


拍干酶标板上残留的液体;100 μL/孔的量加入新鲜配制的显色液,室入 50 μL 的硫酸终止液终止反应,蓝色和 T-A 片段的扩增以及阳性克隆验犬瘟热病毒 F 基因胞外区序列,PCR 产物特异性目的条带,和预期条带的大小一致,将其连接至 pMD-19T(simple)克隆载含氨苄抗性的 LB 固体培养基上,经过夜培体培养基,37 ℃培养 3 h,通过菌液 PC)。

阳性克隆,片段,体用,预期结果


图 2-2. 连接产物转化阳性克隆结果M: Trans2K Plus II DNA Maker;1、2: 阴性克隆;3-10: 阳性克隆Fig. 2-2. products were transformed clones resultsM: 1Trans2K Plus II DNA Maker; 1,2: Negative clone; 3-10: Positive clon的片段和载体双酶切鉴定经PCR鉴定后为阳性克隆的质粒,将其和pET-28a表达空载体用N双酶切,经过 1%琼脂糖凝胶电泳,结果显示,获得的目的片段p 和 2300 bp,和预期结果相符(图 2-3)。

阳性克隆,质粒,预期结果,表达载体


图 2-2. 连接产物转化阳性克隆结果K Plus II DNA Maker;1、2: 阴性克隆;Fig. 2-2. products were transformed clones Plus II DNA Maker; 1,2: Negative clone; 3双酶切鉴定阳性克隆的质粒,将其和pET-28a表 1%琼脂糖凝胶电泳,结果显示,获预期结果相符(图 2-3)。
【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 姜雪;张强强;;犬瘟热病毒病原学和诊断研究探讨[J];北京农业;2015年34期

2 张毅;买买提·黑牙斯丁;侯宇;刘英玉;蒋国英;郭庆勇;;3例金毛幼犬犬瘟热病毒病的诊治[J];新疆畜牧业;2013年11期

3 李智丽;王吉贵;孙佳增;王爽;袁道莉;伊宝;马君;刘维全;;犬瘟热病毒全长基因组克隆[J];畜牧与兽医;2012年S1期

4 李桂伟;周庆民;冯万宇;秦博;黄建;;齐齐哈尔地区蓝狐犬瘟热病毒的初步分离鉴定[J];畜禽业;2011年10期

5 彭卫艮;;犬瘟热病毒初期感染的治疗[J];中国牧业通讯;2010年24期

6 陈云政;;犬瘟热病毒研究分析[J];中国畜禽种业;2009年07期

7 金耀忠;朱苗红;李义;;犬瘟热病毒的分离与初步鉴定[J];上海畜牧兽医通讯;2009年06期

8 刘继红;;犬瘟热病毒的研究进展[J];检验检疫科学;2007年Z1期

9 王兰萍,愈慧清,耿荣庆;犬瘟热病毒的研究进展[J];当代畜牧;2001年06期

10 李金中,何洪彬,夏咸柱,殷震,涂长春,金宁一,李佑民;犬瘟热病毒反转录-聚合酶链反应诊断方法的建立和初步应用[J];病毒学报;1999年02期


相关博士学位论文 前10条

1 柏亚铎;犬瘟热病毒、犬冠状病毒入侵宿主细胞机制研究[D];中国农业大学;2005年

2 鞠会艳;犬瘟热病毒基因疫苗与重组犬腺病毒的构建及其实验免疫研究[D];吉林大学;2006年

3 苏凤艳;水貂CDV的分离鉴定及其主要基因的克隆与免疫研究[D];吉林农业大学;2007年

4 简中友;犬瘟热病毒N蛋白体外表达与诊断技术应用研究[D];吉林农业大学;2008年

5 王君玮;貂、狐、貉源犬瘟热病毒分离鉴定与分子生物学特性研究[D];南京农业大学;2008年

6 孙佳善;禽流感、新城疫和犬瘟热病毒单克隆抗体筛选策略比较及应用研究[D];东北农业大学;2016年

7 李全;犬瘟热病毒、犬细小病毒及狂犬病毒三联多表位重组蛋白的构建及其免疫效果研究[D];中国农业大学;2017年

8 李天松;不同宿主来源犬瘟热病毒遗传分析与生物学特性研究[D];吉林农业大学;2012年

9 刘大飞;犬瘟热、细小病毒病、腺病毒病(Ⅰ型)三联活疫苗的研制[D];东北林业大学;2015年

10 易立;犬瘟热病毒N蛋白单克隆抗体的制备和特性研究及犬细小病毒VP2基因变异分析[D];中国农业科学院;2015年


相关硕士学位论文 前10条

1 徐刚;犬瘟热病毒单克隆抗体的筛选与双抗体夹心ELISA的建立[D];西北农林科技大学;2019年

2 曹雪峰;不提取核酸直接检测犬细小病毒和犬瘟热病毒以及细小病毒的遗传进化分析[D];四川农业大学;2017年

3 闫小更;表达IL-7的重组犬瘟热病毒的构建与鉴定[D];华中农业大学;2018年

4 王小龙;犬瘟热病毒的分离鉴定及分离株LNDL(17)M4的致病性研究[D];西北农林科技大学;2018年

5 李翠霞;表达狂犬病病毒G蛋白重组犬瘟热病毒Snyder Hill株的研究[D];中国农业科学院;2018年

6 刘天宇;犬瘟热病毒H基因与犬IL-6融合基因的克隆与原核表达[D];吉林农业大学;2017年

7 刘传毅;毛皮动物犬瘟热病毒分离鉴定及分子生物学特性研究[D];山东农业大学;2017年

8 王铮;犬瘟热病毒胶体金检测试纸的制备与初步应用[D];吉林农业大学;2014年

9 郭抗抗;貉源犬瘟热病毒分离鉴定及其H、F基因序列分析[D];江苏科技大学;2013年

10 宋爽;犬瘟热病毒分离方法的比较研究[D];长春理工大学;2009年



本文编号:2844268

论文下载
论文发表

本文链接:http://www.bigengculture.com/yixuelunwen/dongwuyixue/2844268.html

分享