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基于~1H-NMR技术的产后卵巢静止奶牛乳清代谢谱分析

发布时间:2020-10-18 11:24
   近年来,随着奶牛养殖集约化、规模化的发展和产奶基因的选择,奶牛产奶量不断提高,而繁殖效率却逐渐下降,这严重影响我国奶牛业的健康可持续发展。奶牛产后卵巢静止是产后乏情类型之一,是由卵巢暂时性紊乱,卵泡不进行周期性活动引起。奶牛产后卵巢静止是多因素作用的结果,其中泌乳和营养(能量负平衡)是最重要的两个因素。然而,目前有关奶牛产后卵巢静止乳清代谢组学以及与血清代谢组学的关系未见报道。因此,本研究应用一维氢谱核磁共振(1H-Nuclear magnetic resonance,1H-NMR)代谢组学技术,筛选卵巢静止奶牛乳清和血清的差异代谢物,明确差异代谢物之间的相互作用及其与奶牛卵巢静止的关系,为揭示奶牛产后卵巢静止的发病机理提供了科学依据。本研究在黑龙江某集约化牛场随机选取年龄、胎次、体况相近的上年度年泌乳量接近10吨的健康经产奶牛共60头。在产后45-60天根据奶牛的发情表现、直肠检查、B超检查以及生殖激素检测结果,最终选取14头正常发情奶牛为对照组(A)和14头卵巢静止奶牛为试验组(B)。开展了两组奶牛的血液临床病理学分析,然后应用1H-NMR技术对两组奶牛的乳清和血清进行检测,结合多元统计分析和单变量分析,筛选出组间差异代谢物,并进行生物信息学分析,阐明差异代谢物参与的代谢通路与奶牛卵巢静止的关系。结果显示:1)卵巢静止奶牛呈现出能量负平衡的状态,表现血中葡萄糖(Glucose,GLU)低、游离脂肪酸(Non esterified fatty acid,NEFA)和β-羟丁酸(3-Hydroxybutyrate,BHBA)都高的临床病理学特征。并且,卵巢静止奶牛和发情奶牛的生殖激素变化符合各自的模式,卵巢静止奶牛血清雌二醇(Estradiol,E2)明显降低。2)通过1H-NMR检测和多元统计分析及单变量分析,筛选出乳清中13种差异代谢物和血清中13种差异代谢物。与正常发情组奶牛相比,卵巢静止组奶牛乳清中琥珀酸、磷酸肌酸、甘氨酸、乙醇酸、乳清酸、肌醇等差异代谢物均升高,丙氨酸、肌酐、磷酸胆碱、乳糖、牛磺酸、半乳糖、葡萄糖-1-磷酸等差异代谢物均降低;血清中BHBA、乙酸、谷氨酰胺、甘氨酸等差异代谢物均升高,丙氨酸、琥珀酸、柠檬酸、肌酐、磷酸胆碱、GLU、肌醇、酪氨酸、组氨酸等差异代谢物均降低。由此可见,卵巢静止奶牛乳和血中除丙氨酸、甘氨酸、肌酐和磷酸胆碱的变化一致外,多数代谢物不相同,这表明奶牛产后卵巢静止发生时乳和血中代谢物存在较大差异,但都表现为机体糖、脂和氨基酸的代谢途径发生了异常变化。结论:本研究明确了能量负平衡引起奶牛产后卵巢静止的血液临床病理学特征,获得了卵巢静止奶牛乳清和血清的代谢谱图及其差异代谢物,构建了奶牛卵巢静止发生时机体代谢调节途径相互作用网络图,揭示了主要的糖代谢、脂代谢和氨基酸代谢的异常途径在奶牛产后卵巢静止发生中所起的作用,为今后深入研究奶牛产后卵巢静止发生机制和防治策略提供了新的方向。
【学位单位】:黑龙江八一农垦大学
【学位级别】:硕士
【学位年份】:2018
【中图分类】:S858.23
【部分图文】:

谱图,乳清,谱图,代谢物


2.2.2.7 差异代谢物筛选和代谢通路分析根据多元统计分析 OSC-PLS-DA 得分图(score plot)、彩色 S 曲线图(S-plot)图和彩色载荷图(loadings plot)得出组间差异代谢物,再通过单变量分析(p < 0.05)对多元统计分析进行验证(当二者矛盾时以单变量分析为准[101]),最终筛选出组间差异代谢物。用 KEGG 数据库搜索差异代谢物的相关代谢通路,再用代谢物分析软件对差异代谢物进行代谢通路分析。2.2.3 试验结果2.2.3.1 乳清代谢组学分析2.2.3.1.1 乳清样品典型1H-NMR 图谱如图 2-1 所示,A、B 分别为发情组和卵巢静止组奶牛典型的1H-NMR 谱图,图中所有信号峰处于 0.5-8.5 ppm,除去 4.4-5.175 ppm 水峰及其影响区域,并将低场区 5.175-8.5ppm 进行扩大 200 倍以便于观察,共指认出 29 种化合物。

乳清,数据


酸;2:乳酸;3:丙氨酸;4:乙酸;5:乙酰胺;6:N-乙酰碳水化合物:2-酮戊二酸;10:柠檬酸;11:肌酸;12:磷酸肌酸;13:肌酐;14:胆油磷酸胆碱;17:乳糖;18:甲醇;19:牛磺酸;20:甘氨酸;21:肌醇24:麦芽糖;25:尿囊素;26:葡萄糖-1-磷酸;27:乳清酸;28:延胡索droxybutyrate; 2: Lactate; 3: Alanine; 4: Acetate; 5: Acetamide; 6: N-acetylcne; 8: Succinate; 9: 2-Oxoglutarate; 10: Citrate; 11: Creatine; 12: Creatine: Choline; 15: O-Phosphocholine; 16: Glycerophosphocholine; 17: Lactose; 1Glycine; 21: myo-Inositol; 22: Glycolate; 23: Galactose; 24: Maltose; 25sphate; 27: Orotate; 28: Fumarate; 29: Hippurate.元统计分析-2 所示,在奶牛乳清样品的1H-NMR 数据 PCA score plot 中,每个代表 95%的置信区间。可以看到两组样品存在一定的分离趋势,,更清楚的研究两组奶牛代谢组差异,运用 OSC 技术并结合 PLS析。

分析图,乳清,分析图,代谢物


研究部分如图 2-3 所示,在 OSC-PLS-DA score plot 中(图 2-3 a),发情组和卵巢静止组奶牛分列左右,明显分开,说明两组间差异显著。针对得分图中的第一主成分,得到对应的彩色 S-plot 图(图 2-3 c)和彩色 loadings plot 图(图 2-3 b、d),来揭示卵巢静止奶牛乳清中的差异代谢物。结合 OSC-PLS-DA score plot、彩色 S-plot、彩色 loadings plot 图共筛选出 10 种差异代谢物。在卵巢静止组,升高的有乙醇酸、肌醇、甘氨酸、磷酸肌酸和乳清酸,下降的有乳糖、牛磺酸、肌酐、半乳糖、磷酸胆碱。甲醇是由于样品处理时挥发不干净造成的差异,所以不计入差异代谢物。
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