当前位置:主页 > 医学论文 > 实验医学论文 >

一株鼠抗人4-1BBL功能性单克隆抗体的研制及生物学特性的研究

发布时间:2019-01-12 08:19
【摘要】: 4-1BBL(CD137L)是Ⅱ型跨膜糖蛋白分子,TNF超家族成员,表达于各种活化的抗原提呈细胞(APC)表面,如IFN-γ活化的巨噬细胞、CD40配体活化的B细胞、单核细胞、树突状细胞(DC)、T细胞、肿瘤细胞等。编码人4-1BBL的基因位于19p13.3。其受体4-1BB(CD137)为TNF受体(TNFR)超家族成员,分子量为30KD的Ⅰ型跨膜糖蛋白,表达于活化的CD4~+T和CD8~+T细胞表面。4-1BB/4-1BBL介导的协同刺激信号可以诱导T细胞的活化,增殖及抗凋亡作用,同时还可维持T细胞的长期生存及提高细胞因子的分泌。4-1BB/4-1BBL可以协同CD28/B7促进T细胞IL-2的分泌,4-1BBL亦可独立于CD28传递协同刺激信号联合TCR信号参与T细胞的活化,并在初次免疫应答的后期,二次免疫应答及免疫记忆中发挥效应。4-1BBL还可介导逆向信号诱导单核细胞、肿瘤细胞的增殖及促进其细胞因子的分泌。这种逆向信号可能在肿瘤免疫应答中起至关重要的作用。4-1BBL分子的激动剂或拮抗剂的研制及其在4-1BB/4-1BBL信号传导调节作用的研究在肿瘤、移植排斥反应、自身免疫性疾病中具有重要的理论研究意义和应用价值。 1.本研究以4-1BBL转基因细胞株L929/4-1BBL为免疫原,免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术,将免疫后小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,以L929/4-1BBL细胞株作为阳性细胞株,以转基因细胞的母本细胞L929作为阴性对照细胞株,经免疫荧光标记分析及抗体分泌阳性孔内细胞的反复筛选并经多次的克隆化培养,最终获得1株持续、稳定分泌鼠抗人4-1BBL单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为3E7。经体外长期传代培养和液氮冻存后复苏,杂交瘤细胞生长良好,分泌抗体的性能稳定。该抗体效价在1:1000以上,纯化后抗体蛋白用于间接免疫荧光分析的用量为0.25~2.0μg/1×10~6细胞。经快速定性试纸法鉴定单抗3E7的重链为IgG1。单抗3E7与商品化单抗C65-485识别4-1BBL分子的抗原位点不同。 2.为了研究单克隆抗体对4-1BBL分子表达细胞的识别和结合,选择表达4-1BBL膜分子的人单核性白血病细胞株U937以及SHI-1、人早幼粒白血病细胞株HL-60、人红白血病细胞株K562、恶性B淋巴瘤细胞株Daudi和骨髓瘤细胞株8226,通过间接免疫荧光标记法及流式细胞仪分析,结果显示,单抗3E7能特异性的地识别上述血液系统恶性肿瘤细胞株上表达的4-1BBL分子。 3.经过细胞计数、光镜观察及流式细胞仪分析证实单抗3E7能介导逆向信号诱导人单核细胞在体外有效扩增(3~4倍),进一步用ELISA检测细胞培养上清,结果显示,单抗3E7能有效地促进单核细胞分泌IL-6和TNF-α。 4.流式细胞仪检测结果显示,HL-60细胞和U937细胞表面表达4-1BBL膜蛋白;与流式结果相应,RT-PCR检测到HL-60细胞和U937细胞有4-1BBL mRNA胞外段转录本,可见HL-60细胞和U937细胞膜表面组成性表达4-1BBL分子。细胞计数结果显示,4-1BBL单抗3E7能显著促进HL-60细胞和U937细胞的体外生长,提示HL-60细胞和U937细胞上的4-1BBL分子同样能够介导逆向信号,并且通过逆向信号促进这两种白血病细胞株的生长,促进其分泌IL-6,使之进入S期的细胞比例增加。 5.用4-1BBL单抗3E7和TLR-4商品抗体标记HL-60细胞,发现HL-60细胞组成性共表达4-1BBL分子和TLR-4分子,激光共聚焦显微镜观测到HL-60细胞上存在4-1BBL与TLR-4的共定位现象。进一步实验发现,4-1BBL与TLR-4在37℃条件下出现了共内吞,由此表明4-1BBL确实在功能上与TLR-4有一定的关系。 综上所述,本研究成功的地获得了1株稳定和特异分泌抗人4-1BBL的功能性单克隆抗体的杂交瘤(3E7),证实所分泌的抗人4-1BBL单克隆抗体通过逆向信号显著地诱导人外周血单核细胞的体外生长。单抗3E7可促进白血病肿瘤细胞株HL-60和U937体外生长和细胞因子分泌。并首次观测到4-1BBL分子和TLR-4分子在HL-60细胞株表面共定位,37℃条件下出现了共内吞。这株抗体为深入探讨肿瘤细胞表达4-1BBL分子的生物学意义提供了物质基础,也为靶向治疗打下了物质基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】:苏州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R392

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 邱玉华,张学光,谢炜,朱学东;一种显著提高小鼠生产单抗腹水产量的新方法[J];中国免疫学杂志;1995年06期



本文编号:2407555


论文下载
论文发表
教材专著
专利申请


    下载步骤:
    1.微信扫码,备注编号 2407555.
    2.
    点击下载


    本文链接:http://www.bigengculture.com/yixuelunwen/shiyanyixue/2407555.html

    ×
    论文发表,推荐期刊