当前位置:主页 > 医学论文 > 实验医学论文 >

Foxp3突变体相关融合蛋白的表达、纯化、鉴定及生物学功能的初步研究

发布时间:2019-01-12 11:50
【摘要】: Foxp3是FOX(forkhead box)家族转录因子中的一员,是调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)的特异性标志,同时对Treg的发生、发育、功能的维持与发挥等方面起着关键作用。研究发现表达外源性Foxp3可使非调节性T细胞具有类似调节性T细胞样的表型及免疫抑制功能。Foxp3的突变可能导致调节性的CD4~+CD25~+T细胞介导的免疫耐受缺陷。 HIV-1(human immunodeficiency virus type 1)基因编码的反式激活蛋白(transactivator,TAT)中的蛋白转导结构域(protein transductiondomain,PTD)能够携带外源性蛋白穿入几乎所有的真核细胞膜而进入细胞浆和细胞核内,同时具有高效、快速的特点。 目的:构建带HIV-1穿膜序列原核表达载体pET28a-PTD-△Foxp3、pET28a-PTD-eGFP-△Foxp3、pET28a-PTD-eGFP-Foxp3,表达并纯化小鼠PTD-△Foxp3、PTD-eGFP-△Foxp3、PTD-eGFP-Foxp3融合蛋白,研究融合蛋白导入细胞的效率及其对T细胞活化增殖的免疫调节功能的影响。 方法:利用基因重组技术构建pET28a-PTD-△Foxp3、pET28a-PTD-eGFP-△Foxp3、pET28a-PTD-eGFP-Foxp3原核表达载体,并在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中表达融合蛋白,经Ni~(2+)分离柱纯化融合蛋白。Western-blot技术检测融合蛋白表达的正确性,流式细胞术检测融合蛋白穿越细胞膜进入小鼠T淋巴细胞瘤株EL-4细胞中的能力,并通过混合淋巴细胞反应初步分析融合蛋白对T细胞活化增殖的影响。 结果:成功构建了pET28a-PTD-△Foxp3、pET28a-PTD-eGFP-△Foxp3、pET28a-PTD-eGFP-Foxp3融合蛋白表达载体,表达并纯化了PTD-△Foxp3、PTD-eGFP-△Foxp3、PTD-eGFP-Foxp3融合蛋白。通过流式细胞术分析证实表达的融合蛋白均能高效的转入细胞内;同时经混合淋巴细胞反应初步表明PTD-eGFP-Foxp3融合蛋白能明显抑制T淋巴细胞的活化增殖能力,而PTD-△Foxp3、PTD-eGFP-△Foxp3突变体融合蛋白抑制T细胞活化增殖的能力丧失。 结论:成功表达具有生物学活性的PTD-△Foxp3、PTD-eGFP-△Foxp3、PTD-eGFP-Foxp3融合蛋白,为进一步更好地研究Foxp3的免疫抑制功能和构建表达人PTD-Foxp3相关融合蛋白奠定了基础。
[Abstract]:Foxp3 is a member of FOX (forkhead box) family transcription factors and a specific marker of regulatory T cell (regulatory T cells,Treg. It also plays a key role in the genesis, development, function maintenance and development of Treg. It has been found that the expression of exogenous Foxp3 can make non-regulatory T cells have a regulatory T-cell-like phenotype and immunosuppressive function. The mutation of Foxp3 may lead to regulatory CD4~ CD25~ T cell-mediated immune tolerance defects. HIV-1 (human immunodeficiency virus type 1) the protein transduction domain (protein transductiondomain,PTD) of the transactivator protein (transactivator,TAT) encoded by the gene can carry foreign proteins into almost all eukaryotic membranes and into the cytoplasm and nucleus. At the same time, it has the characteristics of high efficiency and fast. Objective: to construct a prokaryotic expression vector pET28a-PTD- Foxp3,pET28a-PTD-eGFP- Foxp3,pET28a-PTD-eGFP-Foxp3, with HIV-1 transmembrane sequence and purify mouse PTD- Foxp3,PTD-eGFP- Foxp3,PTD-eGFP-Foxp3 fusion protein. To study the effect of fusion protein on T cell activation and proliferation. Methods: the prokaryotic expression vector of pET28a-PTD- Foxp3,pET28a-PTD-eGFP- Foxp3,pET28a-PTD-eGFP-Foxp3 was constructed by gene recombination technique, and the fusion protein was expressed in Escherichia coli Rosetta (DE3). The fusion protein was purified by Ni~ (2) column. The expression of fusion protein was detected by Western-blot, and the ability of fusion protein to cross cell membrane into mouse T lymphocyte tumor EL-4 cell line was detected by flow cytometry. The effect of fusion protein on T cell activation and proliferation was analyzed by mixed lymphocyte reaction. Results: pET28a-PTD- Foxp3,pET28a-PTD-eGFP- Foxp3,pET28a-PTD-eGFP-Foxp3 fusion protein expression vector was successfully constructed, and PTD- Foxp3,PTD-eGFP- Foxp3,PTD-eGFP-Foxp3 fusion protein was expressed and purified. Flow cytometry showed that the expressed fusion protein could be efficiently transferred into the cells. At the same time, the mixed lymphocyte reaction showed that PTD-eGFP-Foxp3 fusion protein could significantly inhibit the activation and proliferation of T lymphocytes, while the PTD- Foxp3,PTD-eGFP- Foxp3 fusion protein could inhibit the activation and proliferation of T cells. Conclusion: the successful expression of PTD- Foxp3,PTD-eGFP- Foxp3,PTD-eGFP-Foxp3 fusion protein with biological activity lays a foundation for the further study of the immunosuppressive function of Foxp3 and the construction of human PTD-Foxp3 related fusion protein.
【学位授予单位】:江苏大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R341

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 陈忠东,马艳,曾宪端;妊娠滋养叶细胞疾病p21蛋白表达的研究[J];癌症;1999年S1期

2 李治昊;高梅;叶珊;赵京卉;甘友清;;蛋白质转导技术的应用及研究进展[J];西部医学;2007年06期

3 胡晨;王越;陈彬;姜晓梅;李渝萍;娄桂予;张艳;何凤田;周度金;;PNRC多肽通过干扰核受体途径抑制BT474细胞的增殖[J];现代肿瘤医学;2010年06期

4 陈彬;王越;胡晨;阳玉鹏;李渝萍;娄桂予;张艳;何凤田;周度金;;PNRC多肽通过影响Ras信号途径抑制BT-474细胞的增殖[J];中国癌症杂志;2009年03期

5 ;[J];;年期

6 ;[J];;年期

7 ;[J];;年期

8 ;[J];;年期

9 ;[J];;年期

10 ;[J];;年期

相关会议论文 前3条

1 张晨;陈晓超;刘树滔;刘元刚;饶平凡;;融合蛋白PTD-SOD对紫外辐射下L-02细胞的保护和修复能力的研究[A];中国食品科学技术学会第五届年会暨第四届东西方食品业高层论坛论文摘要集[C];2007年

2 刘树滔;张晨;赵花琴;陈晓超;饶平凡;;融合蛋白PTD-SOD对紫外辐射引起的细胞损伤的保护作用[A];中国食品科学技术学会第五届年会暨第四届东西方食品业高层论坛论文摘要集[C];2007年

3 胡晨;王越;陈彬;姜晓梅;李渝萍;娄桂予;张艳;何凤田;周度金;;PNRC多肽通过干扰核受体途径抑制BT474细胞的增殖[A];重庆市生物化学与分子生物学学术会议论文摘要汇编[C];2009年

相关重要报纸文章 前3条

1 吴曼;中国检测技术堪称一流[N];中国国门时报;2002年

2 记者 董惠池;中美UL安全认证合作成果显著[N];中国国门时报(中国出入境检验疫报);2000年

3 特约记者 左世云;中国石油技术开发公司出口土库曼第一套钻机成功投产[N];中国石油报;2002年

相关博士学位论文 前1条

1 张才;NPY对奶牛肝糖异生和脂肪动员关键酶表达的影响[D];吉林大学;2008年

相关硕士学位论文 前2条

1 张美芳;PTD-GFP、PTD-EDAG融合蛋白质的表达、纯化和初步应用[D];天津大学;2008年

2 周小兵;PTD-ΔhNFATminiDBD蛋白在大鼠心脏移植急性排斥模型中的应用研究[D];江苏大学;2010年



本文编号:2407739


论文下载
论文发表
教材专著
专利申请


    下载步骤:
    1.微信扫码,备注编号 2407739.
    2.
    点击下载


    本文链接:http://www.bigengculture.com/yixuelunwen/shiyanyixue/2407739.html

    ×
    论文发表,推荐期刊