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表面多孔PCL-TCP复合支架的构建及其负载纳米DBM涂层修饰作为骨移植替代物的实验研究

发布时间:2020-03-28 21:51
【摘要】:研究目的骨科临床工作中,骨骼的创伤、肿瘤、畸形、退变等疾病的发生、发展和治疗过程中产生的骨缺损一直是外科医生相对棘手的难题之一。骨缺损的治疗离不开骨组织重建,而进行骨缺损的组织结构重建时,需要合适的填充材料来代替原来缺失的骨质。临床中所使用的自体骨、同种异体骨或是其他填充材料都存在或多或少的缺陷。随着骨组织工程和3D打印技术的相继出现,骨移植替代物的研制又迈出了新的方向。理想的骨移植替代物应当具备成骨性、骨诱导性、骨传导性和骨整合性四种特性。聚己内酯(Polycaprolactone,PCL)和磷酸三钙(Tricalcium phosphate,TCP)均为具有生物相容性和生物可降解性的材料,作为复合材料具有良好的传导成骨、诱导成骨特性以及一定的机械强度,针对于这两者的复合材料研究也是当前热点之一。表面形貌的改变,直接影响依附于支架生长的细胞的增殖分化行为,表面粗糙的多孔支架对于细胞成骨分化具有促进作用。脱钙骨基质(Demineralized bone matrix,DBM)作为一种同种异体骨移植替代物,除了含有93%的胶原外,还包含5%的绝大部分成骨诱导因子。通过涂层的方法将DBM依附于骨组织工程支架上,同时将DBM纳米化以最小化其对原有支架形态的影响或许是一种可行的增强成骨效果的涂层修饰方法。本研究以3D打印技术作为制备方法,尝试对PCL和TCP复合支架进行粗糙化改性,并涂层以纳米化DBM,通过一系列物理性能表征、体外细胞学实验和动物体内实验对新型支架的骨缺损修复能力进行初步探索。研究方法首先通过3D打印技术中的熔融沉积成型技术制备PCL-TCP复合支架,并通过有机溶剂蚀刻的方法完成支架纤维的粗糙化改性,制备表面多孔PCL-TCP复合支架,对其微观形貌、孔隙率、力学特性等进行检测;在此基础上,通过真空冻干法将纳米化的DBM负载于表面多孔PCL-TCP复合支架的纤维表面完成涂层修饰。随后,将人骨髓间充质干细胞(BMSC)接种于表面多孔PCL-TCP复合支架及其负载纳米DBM涂层修饰的支架,并以未经任何修饰的PCL-TCP复合支架作为对照,通过CCK-8、ALP活性、钙离子定量、实时荧光定量PCR、Western Blot等检测手段,评价BMSC在不同复合支架上的粘附、增殖和成骨分化效果。最后,构建新西兰兔桡骨中段临界骨缺损模型,将表面多孔nanoDBM-PCL-TCP复合支架和表面多孔PCL-TCP复合支架作为填充材料,同时使用磷酸钙人工骨作为对照,通过术后不同时间点的影像学和组织学检测,对新型支架的体内骨缺损修复能力进行初步研究。研究结果通过熔融沉积成型技术构建的PCL-TCP复合支架存在预先设置的多孔结构,孔隙之间相互联通;经过有机溶液蚀刻形成表面多孔,兼有宏观和微观孔隙,表面粗糙度和孔隙率增大。支架原有孔隙仍保持在500μm左右,新形成的较大的孔洞约50-300μm,较小的孔洞小于10μm;表面多孔PCL-TCP复合支架的力学强度接近人体松质骨的力学强度;负载纳米DBM涂层修饰后仍能存在原有的多孔结构,孔径在50-200μm不等,同时纤维表面涂布有大量形态不规则、大小不等的纳米DBM团块,最小粒径在200-300nm。体外细胞学检测中,相比于PCL-TCP复合支架和表面多孔PCL-TCP复合支架,表面多孔nanoDBM-PCL-TCP复合支架在BMSC的粘附增殖和成骨分化上更具优势,具有更好的骨诱导性。最后的动物实验中,表面多孔nanoDBM-PCL-TCP复合支架在体内成骨效果优于表面多孔PCL-TCP复合支架,植入后前者的骨体积分数和骨矿物密度明显高于后者;与商业化的β-TCP人工骨相比,早期成骨纳米DBM涂层支架效果稍好,但最终12周时的成骨结果两种支架基本一致。该结果表明表面多孔nanoDBM-PCL-TCP复合支架具有良好的成骨特性,能够有效促进新骨生成。研究结论本研究所制备的表面多孔nanoDBM-PCL-TCP复合支架具有良好的孔隙结构和近似松质骨的力学特性,它可以促进BMSC的粘附增殖和成骨分化,同时能够促进临界骨缺损的修复。该支架具有良好的体内外成骨能力,有望成为一种具有发展前景的骨移植替代物。
【图文】:

示意图,快速成型系统,基本原理,示意图


电机助推微注射器(MotorAssisted Microsyringe,MAM)快速成型系统(备 PCL-TCP 复合支架。该技术属于 FDM 技术,可以直接导入 STL 格式用 MAM 配套软件设计打印模型。支架打印模型一:为新西兰兔胫腓骨 CT 三维重建模型部分区域(图 试支架的个体化制备,,设计纤维直径 0.3mm,层高 0.25mm,叠加角度°,挤出喷头移动速度 5mm/s;支架打印模型二:为长宽高均为 1cm 的正方体,进行体外物理性能表直径 0.5mm,层高 0.3mm,叠加角度为 0/90°,挤出喷头移动速度 5mmPCL 和纳米 β-TCP 颗粒按照质量配比 10:0、9:1、8:2、7:3 的比例分别预过转矩流变仪均匀混合,经切粒机制备 3D 打印所使用的不同混合比例材料。将预先制备的颗粒状混合材料置入料筒,设定熔融池进料温度 12 110℃,混合材料在熔融池内保温 120 分钟以上,确保充分熔融。融化过电机助推微注射器式精细喷头挤出,纤维层层叠加形成支架。待支架其置入体积分数 70%乙醇中 24 小时,风干后密封保存备用。

复合支架,打印模,支架,CT三维重建


表面多孔 PCL-TCP 复合支架的构建及其负载纳米 DBM 涂层修饰作为骨移植替代物的实验研究二、结果(一)表面多孔 PCL-TCP 复合支架的制备1、表面多孔 PCL-TCP 复合支架的构建通过 3D 打印机成功构建 PCL-TCP 复合支架,支架整体结构可控,可根据 CAD软件自行设计,也可根据影像学数据进行个性化制备(图 1-2)。将 10∶0、9∶1、8∶2、7∶3 质量比例混合各组的支架分别命名为 PCL、PCL-10%TCP、PCL-20%TCP、PCL-30% TCP。其中,PCL-30%TCP 制备过程中喷头极易堵塞,无法完成支架构建。
【学位授予单位】:中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R318.08;R68

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