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用探针法双重定量PCR同时检测乙型肝炎病毒前基因组RNA和DNA

发布时间:2021-04-08 15:59
  现有的抗病毒药物比如核苷类似物(nucleotide analogues,NAs)、聚乙二醇化的干扰素α(PEGylated interferon alpha,PEG-IFNα)等可以有效抑制乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的复制,但是难以清除肝细胞内的HBV共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)。残余的cccDNA容易导致停药后慢性乙型病毒性肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)的复发甚至进展。因此肝内cccDNA的水平是判断乙肝是否被治愈的重要参考指标。然而直接肝脏穿刺活检检测肝内cccDNA的水平属于有创检查,无法作为常规临床检查手段,需要寻找无创的替代手段,比如血清学检查反映肝内cccDNA的水平等。乙型肝炎病毒cccDNA可以生成0.7kb、2.1kb、2.4kb、3.5kb等多种不同长度的转录本,其中3.5kb的前基因组RNA(pregenomic RNA,pgRNA)是唯一能够反转录生成松弛环状DNA(relaxed circular DNA,rc DNA)负链的转录本。r... 

【文章来源】:中国人民解放军海军军医大学上海市 211工程院校

【文章页数】:65 页

【学位级别】:硕士

【部分图文】:

用探针法双重定量PCR同时检测乙型肝炎病毒前基因组RNA和DNA


HBV基因组、不同转录本及引物探针设计位点示意图

标准曲线,标准曲线,体系,退火温度


用探针法双重定量PCR同时检测乙型肝炎病毒前基因组RNA和DNA-17-图1.2在不同退火温度下,普通PCR/双重PCR产物的DNA凝胶电泳图A:以hepG2.2.15的cDNA为模板,在53-60℃等不同退火温度下PCR产物的DNA凝胶电泳图.seqA条带大小118bp,seqB条带大小173bp.Conventional:conventionalPCR,普通PCR;Duplex:duplexPCR,双重PCR;M:Marker;AT:annealingtemperature,退火温度.下同.B:分别以hepG2.2.15/hepG2/SMMC-7721的cDNA为模板,在60/62/64/66℃等不同退火温度下,双重PCR产物的DNA凝胶电泳图.C:在60℃退火温度下,以hepG2.2.15的cDNA为模板,分别进行扩增seqA的普通PCR,扩增seqB的普通PCR和扩增seqA/B的双重PCR,上述PCR产物的DNA凝胶电泳图.(二)生成qPCR标准曲线按照实验方法所述循环参数进行qPCR,检测2.3×107~2.3×103拷贝/μL等5个浓度标准品的Ct值(每个标准品3复孔),设标准品拷贝数为x,以logx为X轴、Ct值为Y轴作标准曲线(图1.3),seqA标准曲线的线性回归方程为y=-3.3517x+37.329,扩增效率99%,相关系数R2=0.9976(图1.3实线);seqB标准曲线的线性回归方程为y=-3.443x+37.341,扩增效率95%,R2=0.9966(图1.3虚线)。同时seqA和seqB线性范围可低至2.3×102拷贝/μL。用双重PCR体系检测1μghepG2RNA用OligodT18作为引物的反转录产物,seqA、seqB的检测值均低于10拷贝/μL或未检出(结果未显示)。以上结果表明该双重PCR检测体系具有较好的灵敏度和特异性。图1.3双重PCR体系的标准曲线实线:seqA标准曲线;虚线:seqB标准曲线.BC

标准曲线,凝胶电泳,退火温度,标准曲线


用探针法双重定量PCR同时检测乙型肝炎病毒前基因组RNA和DNA-17-图1.2在不同退火温度下,普通PCR/双重PCR产物的DNA凝胶电泳图A:以hepG2.2.15的cDNA为模板,在53-60℃等不同退火温度下PCR产物的DNA凝胶电泳图.seqA条带大小118bp,seqB条带大小173bp.Conventional:conventionalPCR,普通PCR;Duplex:duplexPCR,双重PCR;M:Marker;AT:annealingtemperature,退火温度.下同.B:分别以hepG2.2.15/hepG2/SMMC-7721的cDNA为模板,在60/62/64/66℃等不同退火温度下,双重PCR产物的DNA凝胶电泳图.C:在60℃退火温度下,以hepG2.2.15的cDNA为模板,分别进行扩增seqA的普通PCR,扩增seqB的普通PCR和扩增seqA/B的双重PCR,上述PCR产物的DNA凝胶电泳图.(二)生成qPCR标准曲线按照实验方法所述循环参数进行qPCR,检测2.3×107~2.3×103拷贝/μL等5个浓度标准品的Ct值(每个标准品3复孔),设标准品拷贝数为x,以logx为X轴、Ct值为Y轴作标准曲线(图1.3),seqA标准曲线的线性回归方程为y=-3.3517x+37.329,扩增效率99%,相关系数R2=0.9976(图1.3实线);seqB标准曲线的线性回归方程为y=-3.443x+37.341,扩增效率95%,R2=0.9966(图1.3虚线)。同时seqA和seqB线性范围可低至2.3×102拷贝/μL。用双重PCR体系检测1μghepG2RNA用OligodT18作为引物的反转录产物,seqA、seqB的检测值均低于10拷贝/μL或未检出(结果未显示)。以上结果表明该双重PCR检测体系具有较好的灵敏度和特异性。图1.3双重PCR体系的标准曲线实线:seqA标准曲线;虚线:seqB标准曲线.BC

【参考文献】:
期刊论文
[1]慢性乙型肝炎抗病毒治疗相关新型标志物及其临床应用[J]. 鲁凤民,曾婉嘉,文夏杰,廖昊,邹军,王雷婕,席婧媛,王建文,王杰,陈香梅.  肝脏. 2019(05)
[2]慢性乙型肝炎患者血清HBV RNA检测的临床意义[J]. 鲁凤民,窦晓光,张文宏,王福生.  临床肝胆病杂志. 2018(05)
[3]Update on occult hepatitis B virus infection[J]. Manoochehr Makvandi.  World Journal of Gastroenterology. 2016(39)
[4]Effect of oxymatrine on the replication cycle of hepatitis B virus in vitro[J]. Wen-Sheng Xu,Xiao-Hui Miao,Wu Ni,Xiong Cai,Rui-Qi Zhang,Jun-Xue Wang,Department of Infectious Diseases,Changzheng Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200003,China Ke-Kai Zhao,Department of Infectious Diseases,No.404 Hospital,Weihai 264200,Shandong Province,China.  World Journal of Gastroenterology. 2010(16)



本文编号:3125845

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