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丹酚酸B防治人乳头瘤病毒感染及其机制研究

发布时间:2020-09-16 21:09
   研究背景:宫颈癌(Cervical cancer,CC)是目前最常见的妇科恶性肿瘤之一,其已经成为15至44岁女性癌症死亡的第二大主要病因。流行病学研究表明,99.7%的宫颈癌患者均伴有高危型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)感染。人乳头瘤病毒是嗜上皮性DNA病毒,在众多的HPV亚型中,约40种能感染生殖道粘膜,其中高危型HPV-16和18型感染导致了 70%以上的宫颈癌的发生,低危型HPV如HPV-6、11等则主要引起感染部位的低度病变、生殖器或皮肤疣和尖锐湿疣。高危型HPV病毒的持续性感染是导致细胞发生癌变的重要条件。通常,病毒感染会导致细胞分泌大量炎症因子,从而导致慢性炎症的发生。而慢性炎症在在肿瘤形成过程中发挥着重要的作用,癌相关炎症因子的高表达能促进肿瘤的侵袭,从而促进肿瘤远处转移和血管生成。随着肿瘤的生长,其内部供氧不充分,该缺氧环境导致肿瘤细胞生成更多新生血管,以补给供氧。同时,癌相关炎症因子通过激活多种信号通路,促进肿瘤血管生成,加快肿瘤生长和转移。中药单体丹酚酸B(Salvianolic acid B,SalB)是丹参主要的水溶性组分之一,在众多丹参的酚酸提取物中含量最为丰富,且具有多种生物学活性,其被报道具有抗炎、抗氧化、调节凋亡、抑制血小板聚集、改善冠状微循环等作用。我们前期研究发现,丹酚酸B能有效抑制三株HPV假病毒株感染靶细胞,本研究深入探讨了丹酚酸B发挥抗HPV病毒的作用机制。另外,由于丹酚酸B本身具有较好的抗炎活性,本研究进一步探讨了丹酚酸B对HPV感染后细胞炎症因子表达和肿瘤细胞血管生成的影响。本文研究的丹酚酸B来源广泛、价格低廉、水溶性高、毒副作用小,且具有高效抗HPV及抗炎活性,因此极有可能被开发成为一类新的安全高效的双功能抗HPV杀微生物剂用于防治HPV感染,减少宫颈癌的发生。研究方法:1.体外假病毒体系评估丹酚酸B抗HPV病毒效果,Time-of-addition、流式细胞术、Temperature shift、表面等离子共振等方法检测丹酚酸B发挥抗病毒作用的可能作用机制和靶点;2.荧光定量PCR、酶联免疫吸附(ELISA)法检测丹酚酸B对HPV感染诱发的炎症因子表达的影响;3.荧光定量PCR、酶联免疫吸附(ELISA)、Western blotting法检测丹酚酸B对氯化钴诱导的宫颈癌细胞HIF-1α、VEGF蛋白及其调节通路的影响;4.MTT法检测丹酚酸B对正常生殖道细胞和子宫颈癌细胞的毒性作用;通过病理切片、ELISA及免疫组化法检测丹酚酸B凝胶对家兔阴道粘膜的刺激性。研究结果:1.丹酚酸B能剂量依赖性地抑制HPV病毒感染靶细胞,其主要抑制病毒进入靶细胞的早期阶段,能与病毒的主要衣壳蛋白L1特异性结合,进而抑制HPV病毒颗粒黏附于靶细胞表面;2.丹酚酸B能剂量依赖性地下调HPV感染HeLa细胞后炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8 mRNA的表达,降低IL-6、IL-8蛋白的表达;3.丹酚酸B能剂量依赖性地下调氯化钴诱导的宫颈癌Siha细胞HIF-1α及下游VEGF蛋白的表达,其通过影响PI3K/AKT和ERK1/2通路抑制HIF-1α蛋白的合成;4.丹酚酸B对正常生殖道细胞和子宫颈癌细胞基本无毒,其CC50均大于800μg/ml。家兔阴道刺激性实验结果显示,丹酚酸B凝胶对家兔阴道上皮无损伤,对阴道粘膜炎症因子的释放无明显影响,不会引起的阴道上皮细胞和基质细胞的异常增殖。研究结论:丹酚酸B能抑制HPV病毒感染靶细胞的早期阶段,其直接靶向病毒L1蛋白,阻止病毒黏附入侵靶细胞,进而发挥抗病毒作用。此外,丹酚酸B能够有效抑制HPV感染所诱发的炎症反应和肿瘤细胞血管生成。丹酚酸B对正常生殖道细胞和子宫颈癌细胞基本无毒,不会诱导家兔阴道粘膜炎症反应,安全性较高,因此极有可能被开发成为一类安全高效的多功能抗HPV杀微生物剂用于防治HPV感染。
【学位单位】:南方医科大学
【学位级别】:硕士
【学位年份】:2018
【中图分类】:R285
【部分图文】:

靶细胞,病毒,抗病毒活性,病毒感染


逦100逡逑Concentration邋of邋Salvianolic邋acid邋B邋(^g/ml)逡逑图1-1:丹酚酸B能显著抑制HPV病毒感染靶细胞(A.HPV-6;B.HPV-16;C.HPV-18)逡逑Figure邋1-1:邋The邋inhibition邋of邋salvianolic邋acid邋B邋on邋HPV邋infection邋(A.HPV-6;邋B.HPV-16;逡逑C.HPV-18)逡逑2.丹裔酸B能作用在病栜入酬胞的早期阶段逡逑通过Time-of-addition实验,即在病毒入侵耙细胞的不同时间点(0、2、4、逡逑6、8、10和12邋h)加入丹酚酸B,观察其抗病毒活性的变化,分析药物可能的逡逑作用环节。实验结果发现,在病毒进入靶细胞前加入丹酚酸B邋(50卩g/ml),其逡逑几乎完全抑制HPV病毒的复制,抑制率达80?100%邋(图1-2)。但当在病毒感逡逑染靶细胞后加入丹酚酸B时,其抗病毒活性逐渐下降,且随着病毒感染时间的逡逑延长,丹酚酸B抗病毒活性也进一步下降。上述结果提示,丹酚酸B对病毒进逡逑15逡逑

丹酚酸B,靶细胞


3.丹酚酸B抑制HPV病毒结合靶细胞逡逑病毒结合靶细胞是HPV感染宿主细胞的第一步,前述结果提示丹酚酸B可逡逑能在病毒感染细胞的早期阶段发挥作用,这种作用是否是由于药物抑制了病毒逡逑与靶细胞之间的结合呢?由于HPV邋L1基因编码的HPV邋L1蛋白是HPV的主要逡逑衣壳蛋白,其是介导病毒入侵靶细胞的关键因子。这里,我们采用免疫荧光染逡逑色法对感染细胞表面的HPV邋16邋L1蛋白染色,观察药物对细胞表面L1蛋白表达逡逑的影响。将丹酚酸B与HPV16病毒混合液加入HeLa细胞中孵育,24h后弃上逡逑清,对HPV邋16邋L1蛋白进行荧光染色后观察发现,HPV病毒处理组中,细胞表逡逑面观察到显著的L1蛋白荧光表达(图1-3邋B),邋10邋pg/ml丹酚酸B处理组(图1-3逡逑C)与100pg/ml丹酚酸B处理组(图1-3D)中细胞表面L1蛋白的荧光表达量逡逑显著下降,且呈剂量依赖性。上述结果表明,丹酚酸B能有效抑制HPV与靶细逡逑胞的结合。逡逑A逦B逡逑

病毒组,细胞黏附,病毒,靶细胞


12、25、50及100jxg/ml)丹酚酸B的HPV病毒颗粒,其黏附靶细胞的能力明逡逑显下降,后期恢复生理条件时,病毒内吞并感染靶细胞的能力显著下降,且具逡逑有显著的剂量依赖性(图1-4)。上述结果表明,丹酚酸B能一定程度地抑制HPV逡逑病毒黏附靶细胞,进而抑制病毒内吞入胞过程,其可能是丹酚酸B抗HPV病毒逡逑的作用机制之一。逡逑20000邋t逦^邋HPV-16逡逑_邋15000-邋g逦***逦E3邋HPV-18逡逑皇逦W 逦i逦*:逦***逡逑h邋5000N■柋哢?逦***逡逑!逦3000

本文编号:2820376

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