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ST3GAL家族和ST6GALNAC家族在人慢性粒细胞白血病多药耐药性中的作用

发布时间:2019-12-06 12:38
【摘要】:慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)是基于多能干细胞水平上的恶性疾病,特点是具有获得性的异常的染色体,是一种造血干细胞恶性疾病,以骨髓及外周血中粒细胞的无限增殖为主要特征。特异性的细胞遗传学变化在大约95%的慢性粒细胞白血病患者中都有发生,具体表现为9号和22号染色体发生易位,导致形成费城染色体(Ph染色体),并且产生BCR/ABL融合基因,其对应的融合蛋白具有可以异常升高酪氨酸蛋白激酶活性的特点,此融合蛋白可以催化并且磷酸化多种底物蛋白酪氨酸残基,继而激活多条信号传导途径,促进细胞增殖,减少细胞凋亡。目前,在慢性粒细胞白血病的治疗中,酪氨酸激酶抑制剂被广泛应用并且取得了很好的疗效。但是,临床上对该药物的耐药越来越明显,研究并探索其他的治疗方法已经成为白血病治疗过程中急需解决的问题。唾液酸转移酶在肿瘤细胞中的调节作用最近被广泛的关注。而且,有许多世界各地的学者已经致力于研究多糖的变化与恶性肿瘤化疗耐药之间的关系,细胞膜上糖蛋白糖链的变化己经被确定了与白血病的耐药相关。然而,唾液酸转移酶在肿瘤的多药耐药中的作用尚未被完全了解。MicroRNA是一个大小约为22-25个碱基的微小分子,由于其具有着复杂的信号网络以及对细胞的生物学行为具有多方面的影响,因此microRNA已经成为当前世界医学研究领域中的新前沿热点。MicroRNA与肿瘤疾病包括白血病之间的密切联系已经为人们所了解。然而,microRNA以某种唾液酸转移酶为靶点对慢性粒细胞白血病多药耐药性的调节作用尚未被知晓。本实验对ST3GAL家族和ST6GALNAC家族在慢性粒细胞白血病多药耐药中的作用进行研究,同时研究microRNA在慢性粒细胞白血病多药耐药中所具有的调节作用。目的:通过研究ST3GAL和ST6GALNAC家族在三对人慢性粒细胞白血病细胞株及慢性粒细胞白血病患者外周血单个核细胞中的差异表达,明确ST3GAL和ST6GALNAC家族与人慢性粒细胞白血病多药耐药的相关性,并且研究miR-4701-5p以ST3GAL1作为靶点和miR-4299以ST6GALNAC4为靶点对人慢性粒细胞白血病多药耐药的影响,从而为预测和诊断慢性粒细胞白血病多药耐药性,寻求逆转药物提供新策略和靶点。方法:(1)采用real-time PCR技术和western-blot技术检测三对人慢性粒细胞白血病细胞株及慢性粒细胞白血病患者外周血单个核细胞中的ST3GAL和ST6GALNAC家族的表达情况,筛选出具有差异表达ST基因。(2)特异性下调、上调差异表达的ST3GAL1基因和ST6GALNAC4基因,检测干扰、过表达前后KCL22/ADR、KCL22细胞在体内、体外对化疗药物敏感性的变化。(3)采用real-time PCR检测三对化学敏感和化学耐药的人慢性粒细胞白血病细胞株和临床慢性粒细胞白血病患者外周血单个核细胞中miR-4701-5p和miR-4299的表达变化。miR-4701-5p的模拟物(100nM)转染到KCL22细胞中,将miR-4701-5p的拮抗剂转染到KCL22/ADR细胞中,然后检测ST3GAL1表达的变化。将miR-4299的模拟物(100nM)转染到KCL22/ADR细胞中,将miR-4299的拮抗剂转染到KCL22细胞中,然后对ST6GALNAC4表达的变化进行检测。将ST3GAL1和ST6GALNAC4的3’-UTR的靶基因序列(wt 3’-UTR)和ST3GAL1和ST6GALNAC4的突变基因序列(mt 3’-UTR)克隆到荧光素酶报告基因载体,然后将wt.3'-UTR或mt 3’-UTR载体和miR-4701-5p模拟物转染到KCL22细胞中以及miR-4299模拟物转染到KCL22/ADR细胞中,进行荧光素酶活性检测。(4)将miR-4701-5p的模拟物转染到KCL22细胞中,而miR-4701-5p的拮抗剂转染到KCL22/ADR细胞中,将miR-4299的模拟物转染到KCL22/ADR细胞中,而miR-4299的拮抗剂转染到KCL22细胞中,检测化学药物阿霉素、紫杉醇和长春新碱的IC50值,用以研究miR-4701-5p和miR-4299是否可以在体外调节CML细胞的药物敏感性。将转染了,miR-4701-5p的激活剂、,niR-4701-5p的拮抗剂、miR-4299的激活剂、miR-4299的拮抗剂和阴性对照的KCL22细胞和KCL22/ADR细胞接种到裸鼠体内,测量小鼠肿瘤体积;qRT-PCR和western blotting方法检测肿瘤组织中ST3GAL1、ST6GALNAC4、miR-4701-5p和miR-4299的表达情况。第一部分结果:(1) ST3GAL2和ST3GAL3在KCL22、K562和KU812细胞中的表达与其阿霉素耐药细胞株的表达在统计学上无明显差异;ST3GAL1和ST3GAL5在三种药物敏感的亲本细胞株中基因及蛋白的表达明显增高(*P0.05);ST3GAL4在三种耐药细胞系中呈现高表达(*P0.05);而ST3GAL6在三对慢性粒细胞白血病细胞株中无表达。(2) ST3GAL4在CML/MDR患者外周血单个核细胞中呈高表达(*P0.05);ST3GAL1和ST3GAL5在CML组中呈高表达(*P0.05);ST3GAL2和ST3GAL3的表达在两组中无明显差异;ST3GAL6在两组中表达量较低。(3)干扰ST3GAL1后的KCL22细胞株在:mRNA和蛋白水平上的表达均显著降低,作用于KCL22-ST3GAL1 shRNAl细胞的抗肿瘤药物的IC50值明显高于对照组。未经阿霉素治疗的小鼠在第21天到第28天期间,可以观察到注射KCL22-ST3GAL1 shRNAl的小鼠平均瘤体积(891士92 mm3)显著高于shRNA对照组(585士62 mm3,*P0.05)。在经阿霉素治疗的小鼠中亦存在相同的现象。(4)特异性上调ST3GAL1后,作用于KCL22/ADR/ST3GAL1细胞的抗肿瘤药物的IC50值明显低于KCL22/ADR/mock细胞的IC50值。小鼠在注射KCL22/ADR/ST3GAL1后的平均瘤体积明显低于注射KCL22/ADR/mock的小鼠。给小鼠注射同样的KCL22/ADR/ST3GAL1,经过阿霉素治疗的小鼠平均瘤体积明显小于未经过阿霉素治疗的小鼠。(5) MiR-4701-5p的表达量在KCL22、K562和KU812细胞和慢性粒细胞白血病患者外周血单个核细胞中显著下降,而ST3GAL1在化学敏感细胞株及药物敏感患者的细胞中表达是升高的。转染了模拟物的KCL22细胞中ST3GAL1的mRNA及蛋白的表达量明显下降,在转染了miR-4701-5p拮抗剂的KCL22/ADR细胞中,ST3GAL1的mRNA及蛋白的表达量明显上升。转染了wt3’-UTR载体的KCL22细胞中miR-4701-5p表达的荧光素酶活性明显下降,但是此结果可以被mt ST3GAL1逆转。(6) MiR-4701-5p的高表达可显著抑制KCL22细胞对化学药物的敏感性,阿霉素、紫杉醇和长春新碱的IC50值升高。同时,在KCL22/ADR细胞中miR-4701-5p被拮抗剂所抑制后,可观察到这三种化疗药物的IC50值下降。转染了miR-4701-5p的小鼠的肿瘤体积在经过阿霉素化疗后有明显的改变,并且通过改变miR-4701-5p的表达可以调节ST3GAL1 mRNA和蛋白的表达。第二部分结果:(1) ST6GALNAC1、ST6GALNAC2和ST6GALNAC6在KCL22.K562和KU812细胞中的表达与其阿霉素耐药细胞株的表达在统计学上无明显差异。ST6GALNAC4在三种耐药细胞系中呈现高表达(*P0.05);而ST6GALNAC3和ST6GALNAC5在三对慢性粒细胞白血病细胞株中无表达。(2) ST6GALNAC4在CML/MDR患者外周血单个核细胞中呈高表达(*P0.05)。ST6GALNAC1、ST6GALNAC2和ST6GALNAC6的表达在两组中无明显差异。ST6GALNAC3和ST6GALNAC5在两组中表达量较少。(3)干扰ST6GALNAC4后的KCL22/ADR细胞株在mRNA和蛋白水平上的表达均显著降低,作用于KCL22/ADR-ST6GALNAC4 shRNA1细胞的抗肿瘤药物的IC50值明显低于对照组。在经阿霉素治疗的小鼠和未经阿霉素治疗的小鼠中,注射KCL22/ADR-ST6GALNAC4 shRNA1的小鼠平均瘤体积均显著低于shRNA对照组(*P0.05)。(4)过表达ST6GALNAC4,作用于KCL22/ST6GALNAC4细胞的抗肿瘤药物的IC50值明显高于KCL22/mock细胞的IC50值。在经过阿霉素治疗的小鼠和未经阿霉素治疗的小鼠中,注射KCL22/ST6GALNAC4后的平均瘤体积均明显高于KCL22/mock组。(5)在KCL22、K562和KU812细胞以及慢性粒细胞白血病患者外周血单个核细胞中miR-4299的表达量明显上升,而ST6GALNAC4在化学敏感细胞株及药物敏感患者的细胞中表达是下降的。在KCL22/ADR细胞中转染了miR-4299模拟物后,ST6GALNAC4的mRNA及蛋白的表达量明显的下降;在转染了miR-4299拮抗剂的KCL22细胞中,则表现出相反的结果。而且,转染了wt 3'-UTR载体的KCL22/ADR细胞中miR-4299表达的荧光素酶活性明显下降,但是mtST6GALNAC4可以逆转此结果。(6)MiR-4299的高表达可上调KCL22/ADR细胞对化学药物的敏感性,阿霉素、紫杉醇和长春新碱的IC50值下降;同时,在KCL22细胞中miR-4299被拮抗剂所抑制后,可观察到这三种化疗药物的IC50值上升。转染了miR-4299的小鼠的肿瘤体积在经过阿霉素化疗后有明显的改变,并且改变miR-44299的表达可以调节ST6GALNAC4 mRNA和蛋白的表达。结论:(1) ST3GAL家族和ST6GALNAC家族在三对人慢性粒细胞白血病亲本细胞株及其三对化学耐药细胞株中存在差异表达。(2) ST3GAL家族和ST6GALNAC家族在耐药与非耐药的慢性粒细胞白血病患者外周血单个核细胞中存在差异表达。(3)改变ST3GAL1和ST6GALNAC4的表达,可以调控KCL22和KCL22/ADR细胞体内、外的药物敏感性。ST3GAL1和ST6GALNAC4可以作为临床慢性粒细胞白血病多药耐药的诊断和预后的标记物,可作为治疗白血病耐药性潜在的靶点。(4) MiR-4701-5p以ST3GAL1为靶点和miR-4299以ST6GALNAC4为靶点,可作为慢性粒细胞白血病多药耐药性所特有的miRNA来调节慢性粒细胞白血病细胞的多药耐药性。
【图文】:

阿霉素,小鼠,对照组


通过测量所形成的肿瘤体积来验证阿霉素的治疗效果。图2D所示,在逡逑阿霉素治疗组中的小鼠所形成的肿瘤体积随着时间的延长而增长,,但其肿瘤体积逡逑X棾さ乃俾室飨缘陀谖淳⒚顾刂瘟频男∈蟆J导噬希淳⒚顾刂瘟频男″义鲜笤诘冢玻碧斓降冢玻柑炱诩洌桑坠鄄斓阶⑸洌耍茫蹋玻玻粒模遥澹樱裕叮牵粒蹋危粒茫村澹螅瑁遥危粒戾义系男∈笃骄鎏寤贾陀冢螅瑁遥危炼哉兆椋ǎ校迹埃埃担T诰⒚顾刂瘟频男∈笾凶㈠义仙洌耍茫蹋玻玻粒模遥澹樱裕叮牵粒蹋危粒茫村澹螅瑁遥危粒斓男∈笃骄鎏寤嗍窍灾陀冢螅杳瘢危铃义隙哉兆椋ㄟ担迹埃埃担e义

本文编号:2570389

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